康生朝 楊婉 鄭英 盧利霞 熊婉媛 董敏 于曉輝

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的高度惡性腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤中排第二位，并且在中國(guó)的死亡率還在逐年增長(zhǎng)[1-2]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞間信號(hào)傳遞的必要過(guò)程，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)作為MAPK家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，廣泛存在于各種組織，參與細(xì)胞的增殖分化，多種生長(zhǎng)因子受體、營(yíng)養(yǎng)相關(guān)因子受體等都需要ERK的活化來(lái)完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。ERK包括了兩種異構(gòu)體ERKl和ERK2，其激活對(duì)于Ras誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子的激活以及激酶的激活至關(guān)重要。前期研究發(fā)現(xiàn)，ERK在HCC組織中高表達(dá)，提示HCC的發(fā)生與ERK信號(hào)通路相關(guān)[3]，可以抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移。因此，探索苦參堿是否以ERK信號(hào)通路上的ERK蛋白為靶點(diǎn)抑制HCC細(xì)胞生長(zhǎng)，一方面可以為苦參堿的抗癌作用提供分子理論基礎(chǔ)，另一方面可以為中藥的譴方用藥及中藥分子靶向領(lǐng)域治療肝癌提供新思路[4]。

資料和方法

一、細(xì)胞來(lái)源

實(shí)驗(yàn)采用人HepG2肝癌細(xì)胞系，于2014年9月購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所，以液氮凍存包裝送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，立即置于-80℃冰箱保存以備用。

二、主要試劑

苦參堿(上海Aladdin公司)，ERK1/2單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，PCR試劑盒(日本Takara公司)，Western-Blot試劑盒(英國(guó)Abcam公司)，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基。

三、主要器材

96孔、24孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，移液器(0.5～10 μL、10～100 μL、 100～1 000 μL、1 000～5 000 μL)。

四、研究方法

(一)RT-PCR檢測(cè) 分別提取終濃度為1、2、4 mg/mL苦參堿干預(yù)和20 μL PD98059干預(yù)后的細(xì)胞總RNA，在冰上加入裂解液裂解細(xì)胞，4℃離心機(jī)分離RNA，加入10 μL RNase-free水溶解RNA。用5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)、Total RNA、RNase Free dH20混合成cDNA工作液，經(jīng)37 ℃、85 ℃和4 ℃溫度變化合成cDNA。ERK上游引物序列為：5′-TATGCTAATCCTGCTGTGTT-GTCTA-3′，下游引物序列為：5′-AAATGTTGTG-CAGGCGAATG-3′；β-actin引物序列為：5′-GCACC-GTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列為：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。依照該引物序列進(jìn)行ERK核酸的逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。測(cè)得Ct值用2-ΔΔCt(Livak)處理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)來(lái)分析RT-PCR產(chǎn)物。

(二)Western-Blot檢測(cè) 提取各組蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。灌注濃縮膠和分離膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜后，封閉一抗，4℃冰箱過(guò)夜，再孵二抗。按照ECL A∶ECL B=1∶1比例混勻進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，把載有PVDF膜的玻璃板置于凝膠成像分析儀中，用凝膠成像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白分子量和凈光密度值。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件處理，結(jié)果以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、苦參堿抑制HepG2細(xì)胞中ERK mRNA的表達(dá)

經(jīng)苦參堿作用后ERK mRNA的表達(dá)量顯著下降，4 mg/mL、2 mg/mL與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而1 mg/mL與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，4 mg/mL、2 mg/mL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而1 mg/mL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明4 mg/mL、2 mg/mL明顯抑制HepG2細(xì)胞ERK核酸的表達(dá)(見圖1)。

注：*為與空白對(duì)照組比較P<0.05；△為與陽(yáng)性對(duì)照組(PD98059)比較P<0.05；#為實(shí)驗(yàn)組組間比較4 mg/mL與1 mg/mL和2 mg/mL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，1 mg/mL和2 mg/mL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

二、苦參堿抑制HepG2細(xì)胞中ERK及p-ERK蛋白含量的表達(dá)

與空白對(duì)照組相比，p-ERK水平隨著苦參堿濃度的增加而下調(diào)；2 mg/mL、4 mg/mL苦參堿作用后表達(dá)的蛋白與空白對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而1 mg/mL苦參堿作用后p-ERK的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；1 mg/mL、2 mg/mL作用后p-ERK的表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而4 mg/mL作用后的蛋白表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)差異。見表1和圖2。

表1 Western blot方法檢測(cè)ERK及p-ERK蛋白表達(dá)

注：灰度值統(tǒng)計(jì)方法為：測(cè)量積分光密度，積分光密度=條帶面積×平均密度；*為實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照相比，P<0.05，**<0.01；△為實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，P<0.05，△△<0.01

注：灰度值統(tǒng)計(jì)方法為：測(cè)量積分光密度，積分光密度=條帶面積×平均密度

討 論

苦參堿是目前臨床上選擇的高效低毒藥物，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤如膽囊癌、骨肉瘤等均有重要作用，主要參與抑制腫瘤增殖與凋亡[5]。前期研究已證實(shí)苦參堿可以抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖及遷移[6]。此外，苦參堿對(duì)肝癌的抑制作用已經(jīng)應(yīng)用于臨床，有體外研究認(rèn)為，不同的苦參堿衍生物對(duì)不同的肝癌細(xì)胞有特異性[7]，其間更深層的機(jī)制可能是通過(guò)ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HCC發(fā)生發(fā)展中起著傳播和放大信號(hào)的作用[8]，主要傳遞上皮和間葉細(xì)胞中的信號(hào)，同時(shí)在化學(xué)治療中起著重要作用[9]。很多研究報(bào)道通過(guò)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以調(diào)控HCC的發(fā)生發(fā)展[10]。因此該條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵蛋白ERK備受關(guān)注。本研究選用苦參堿，試圖降低ERK及p-ERK在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。采用免疫熒光印跡法和Real-Time PCR法，從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)苦參堿對(duì)ERK關(guān)鍵蛋白的影響以及對(duì)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。苦參堿干預(yù)后，ERK核酸表達(dá)量隨著苦參堿濃度的增加而下降，ERK蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄水平的mRNA ERK趨勢(shì)一致，說(shuō)明當(dāng)苦參堿作用于HepG2細(xì)胞后，ERK信號(hào)通路的活性喪失，HCC細(xì)胞無(wú)法通過(guò)該條通路傳遞相應(yīng)的增殖及遷移信號(hào)，從而發(fā)揮對(duì)HCC的抑制作用。在Western-Blot檢測(cè)中，苦參堿與陽(yáng)性對(duì)照組PD98059相比，阻斷ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的效應(yīng)以4 mg/mL濃度為最強(qiáng)，ERK及p-ERK表達(dá)量在4 mg/mL濃度時(shí)最低，且用4 mg/mL苦參堿作用HepG2肝癌細(xì)胞后與陽(yáng)性對(duì)照組PD98059的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明苦參堿可能存在與PD98059類似的阻斷ERK效應(yīng)。

本研究提示苦參堿抑制HCC的分子機(jī)制是通過(guò)下調(diào)ERK的核酸及蛋白表達(dá)水平抑制ERK信號(hào)通路。而ERK可以成為苦參堿的治療靶點(diǎn)，為苦參堿的分子靶向治療提供理論依據(jù)。