金湛 甘椿椿 陳高 胡高波 姚水洪

（衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江衢州 324000）

乳腺癌是世界三大最常見癌癥之一，并且是女性發(fā)病率最高的腫瘤。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，2012年全球約有1700萬人被診斷患有乳腺癌，而每年約有50萬死于乳腺癌[1]。2018年全球乳腺癌新增病例占所有癌癥的11.6%，與肺癌并列第一，死亡人數(shù)多達(dá)62萬余人[2,3]。所以乳腺癌的診斷和治療顯得尤為重要。目前對乳腺癌的治療手段主要有手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療等，早期診斷出乳腺癌一般可以治愈，然而乳腺癌仍是導(dǎo)致死亡的重要罪魁禍?zhǔn)?，原因可能是由于生活方式改變和缺乏先進(jìn)的診斷和治療手段。因此尋找和開發(fā)新的、低毒高效的治療乳腺癌藥物已刻不容緩[4]。

從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的藥物是新藥開發(fā)項(xiàng)目中的常見的策略，而且 有很多藥物都是基于這一方式發(fā)現(xiàn)的，如紫杉醇、喜樹堿、嗎啡等[5]。白首烏為蘿科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消(CynanchumauriculatumRoyle ex Wight)的干燥塊根，是傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥。中國長期以來白首烏通常被用作功能性食品和滋補(bǔ)劑，常規(guī)治療功效如補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、黑須發(fā)及延年益壽等。現(xiàn)代藥理研究表明，白首烏具有多種藥理作用，包括抗衰老、抗炎、抗腫瘤，抗氧化，免疫調(diào)節(jié)，保肝和脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用等[6-8]。C21甾體苷類化合物通常被認(rèn)為是白首烏的主要活性成分，研究表明其具有顯著抗腫瘤活性[9]，從白首烏中分離得到的C21甾體苷元告達(dá)庭（Caudatin）對人多種腫瘤都具有顯著抑制作用，如胃癌、肝癌、肺癌等[10-12]。然而在生物體中告達(dá)庭通常是以糖苷的形式存在，在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)告達(dá)庭衍生物，告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷（3-O-β-D-cymaropyranoside）對乳腺癌生長具有良好抑制作用[13]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上繼續(xù)探討告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷是否對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 藥物：告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷（Ca-G）自制，純度＞98%，配制成10mg/ml的母液，溶劑為DMSO，于-20℃分裝保存。

1.1.3 試劑：DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Invitrogen公司；MTT、DMSO購自美國Sigma公司；H＆E染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司；anti-cyclin D1，anti-β-tubulin購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含10%胎牛血清的完全DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，密度達(dá)90%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 MTT法測定細(xì)胞活力：收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化并離心后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以3×103個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁完全后，加入不同濃度的Ca-G，濃度梯度設(shè)置為2.5,5,10,15μg/mL，另外設(shè)置溶劑對照組（不加藥，加入DMSO）和空白調(diào)零組（只加培養(yǎng)液、不加細(xì)胞和藥物），均設(shè)4個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL，孵育4h，吸凈孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL的DMSO，震蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶物甲瓚充分溶解，用酶標(biāo)儀于570nm處測各孔吸光度（OD）值，并計(jì)算相對細(xì)胞存活率。相對細(xì)胞存活率(%)=(給藥孔-空白調(diào)零孔/對照孔-空白調(diào)零孔)×100%。

1.2.3 創(chuàng)口愈合：收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化并離心后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為6×105個/皿，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁90%以上后，用200 μl槍頭沿滅菌尺垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕。小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗3遍以洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。更換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，并加入不同濃度梯度藥物（0，5,10 μg/mL）。分別于劃痕 0，12，24 h 在顯微鏡下拍照記錄創(chuàng)口愈合情況，運(yùn)用Image J軟件計(jì)算創(chuàng)口愈合間距和相對創(chuàng)口愈合率（即細(xì)胞相對遷移率）。

1.2.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化并離心后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×105個/ml。在Transwell小室下室加入 500 μl含不同藥物濃度（0，5,10 μg/mL）的10%FBS的完全培養(yǎng)基。上室加入取100 μl細(xì)胞懸液。將細(xì)胞置于37℃，5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。18h后終止培養(yǎng)，取出小室。用甲醇固定，蘇木素和尹紅各染5min，沖去殘余的染料。Transwell小室在正置顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞相對遷移率。

1.2.5 westernblot：收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化并離心后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種于6 cm的培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞貼壁完全后，加入不同濃度藥物（0，5，10μg/mL），培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集各組細(xì)胞。加入適量RIPA裂解液裂解。按照碧云天BCA蛋白含量測定試劑盒說明書檢測樣品蛋白含量，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗，過夜。并加入二抗，按照ECL顯影液試劑盒說明書，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，曝光。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間均數(shù)的比較均采用t檢驗(yàn)，★p＜0.05，★★p＜ 0.01，★★★p＜ 0.001 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)檢測Ca-G對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

2.1 Ca-G對乳腺癌細(xì)胞活力的影響 如圖1所示，MTT結(jié)果顯示不同濃度的Ca-G給藥24 h后，15μg/mL加藥組乳腺癌細(xì)胞株的活力明顯降低，而在15μg/mL以下濃度基本無細(xì)胞毒作用，故在接下來的實(shí)驗(yàn)中選用5，10 μg/mL的濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2 Ca-G對細(xì)胞遷移的影響 在Ca-G非細(xì)胞毒劑量下本研究檢測了Ca-G對乳腺癌細(xì)胞遷移的作用，創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，Ca-G能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞向中心遷移，結(jié)果說明藥物在一定程度能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移。而Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，在加入Ca-G后，從上室穿到下室的細(xì)胞量明顯減少，說明細(xì)胞的遷移率明顯下降，以上結(jié)果均表明Ca-G能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移。

圖2 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測Ca-G對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

2.3 Ca-G對血管生成關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響 大多數(shù)腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），VEGF一般被認(rèn)為是參與腫瘤生長最有效的血管生成因子。VEGFR的活化可導(dǎo)致下游信號通路的激活，如磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT），粘著斑激酶（FAK）。在本研究中，對Ca-G的抗血管生成作用及潛在機(jī)制進(jìn)行了研宄，結(jié)果顯示，Ca-G作用后，VEGF、AKT、FAK蛋白表達(dá)均有所下降。結(jié)果表明，Ca-G通過抑制VEGF/AKT/FAK信號通路顯著抑制乳腺癌細(xì)胞血管生成，結(jié)果如圖3所示。

圖3 Ca-G對乳腺癌細(xì)胞血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

中藥，由于其特殊的藥理活性、低毒性和不易產(chǎn)生耐藥等特點(diǎn)，在癌癥治療中呈現(xiàn)出良好的研究與應(yīng)用前景。白首烏中C21甾體苷在體內(nèi)外研究中，均具有良好的抑制腫瘤作用，告達(dá)庭作為其中一種苷元也起到一定抗腫瘤作用，但是其在白首烏中的含量較低。告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷（Ca-G）是以告達(dá)庭為苷元形成的一種糖苷類化合物。很少報(bào)道其是否具有抗腫瘤作用。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ca-G能夠劑量依賴性地抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，能夠抑制MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞內(nèi)cyclin D1的表達(dá)，可能與阻滯細(xì)胞周期G0/G1期相關(guān)[13]。

對于惡性腫瘤，除了表現(xiàn)無限繁殖特征，并且能夠進(jìn)行局部浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，隨著進(jìn)一步惡化，可滲入周圍的血管和淋巴管，腫瘤細(xì)胞會從這些血管和淋巴管中逃脫，從而進(jìn)入遠(yuǎn)端組織的薄壁組織，在這個過程中不斷地為腫瘤提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，從而引發(fā)的新血管的形成，并幫助去除代謝廢物[14,15]。

細(xì)胞劃痕是指在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，通過制造體外貼壁細(xì)胞創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，來觀察腫瘤細(xì)胞遷移能力的強(qiáng)弱。本研究通過創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)檢測加入Ca-G后MDA-MB-231細(xì)胞的創(chuàng)口愈合能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藥物作用后MDA-MB-231細(xì)胞的創(chuàng)口愈合速度明顯下降，說明Ca-G一定程度可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移。

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)指用聚碳酸酯膜將高營養(yǎng)培養(yǎng)基和低營養(yǎng)培養(yǎng)基隔開，再將腫瘤細(xì)胞放入低營養(yǎng)培養(yǎng)基中，為了得到營養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞必須穿過膜進(jìn)入高營養(yǎng)培養(yǎng)基中，而穿過膜進(jìn)入高營養(yǎng)培養(yǎng)基的細(xì)胞數(shù)的多少就能反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。本研究通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測加入Ca-G后MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力的大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物作用后MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力顯著減弱，說明Ca-G一定程度可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移，本實(shí)驗(yàn)與創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

由腫瘤細(xì)胞增殖和遷移引發(fā)的新血管形成稱為血管生成，在腫瘤生長過程中這種血管不斷為腫瘤提供新的營養(yǎng)物質(zhì)，去除代謝物。如果沒有新血管的形成，腫瘤生長會受到一定限制。因此，血管生成是腫瘤生長的其中一個關(guān)鍵步驟，抗血管生成己成為近年來研究腫瘤治療的關(guān)鍵方法[16,17]。血管生成可受到多種生長因子和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。在這些因子中產(chǎn)生最多的是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），VEGF一般被認(rèn)為是參與腫瘤生長最有效的血管生成因子。VEGF的通過結(jié)合受體酪氨酸激酶來刺激腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和管形成。VEGF受體（VEGFR）活化可導(dǎo)致下游信號通路的激活，如磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT），粘著斑激酶（FAK）[18,19]。本文章研究了Ca-G的抗血管生成作用及潛在機(jī)制，結(jié)果表明，Ca-G通過抑制VEGF/AKT/FAK信號通路顯著抑制乳腺癌細(xì)胞迂移。

總之，告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷可有效抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的遷移和血管生成的活性。這為告達(dá)庭及其衍生物抗腫瘤轉(zhuǎn)移和新生血管生成的進(jìn)一步研究提供一定基礎(chǔ)。