余 茜 張國(guó)麗 敖曉琳

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 四川雅安625000）

微生物蛋白酶作為工業(yè)上主要的蛋白酶制劑來(lái)源，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及生物工業(yè)等方面。目前，關(guān)于微生物蛋白酶的相關(guān)研究主要集中在高產(chǎn)菌株的選育，基因結(jié)構(gòu)及功能方面，對(duì)于金屬離子影響微生物蛋白酶活性及其機(jī)理的研究較少。相關(guān)報(bào)道表明添加一定量的金屬離子可以顯著提高蛋白酶活性。這一研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于微生物蛋白酶制劑的生產(chǎn)及相關(guān)發(fā)酵食品工業(yè)進(jìn)步具有重大意義。

1 微生物蛋白酶主要概述

蛋白酶是一類能催化分解蛋白質(zhì)中的肽鍵斷裂產(chǎn)生氨基酸、多肽或者肽段的酶的總稱。根據(jù)反應(yīng)最適pH 可將蛋白酶分為酸性、 中性和堿性蛋白酶。

蛋白酶分布廣泛，其來(lái)源可分為動(dòng)物、植物和微生物3 個(gè)方面。動(dòng)、植物蛋白酶主要存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高，提取工藝較復(fù)雜和蛋白酶得率較低等問(wèn)題。因此，從動(dòng)、植物中生產(chǎn)蛋白酶已逐漸被微生物替代。微生物蛋白酶主要來(lái)源于真菌、細(xì)菌和病毒，其中真菌以霉菌屬（Aspergillus）為主，細(xì)菌以芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，病毒主要有脊髓灰質(zhì)炎病毒和T4噬菌體，用于工業(yè)生產(chǎn)的微生物蛋白酶主要來(lái)自真菌和細(xì)菌（表1）。

蛋白酶是一種重要的工業(yè)酶，據(jù)統(tǒng)計(jì)蛋白酶的銷售占全球總酶銷售量60%左右[1]。其中70%的工業(yè)蛋白酶用于食品發(fā)酵、皮革加工、清潔劑、明膠產(chǎn)業(yè)等[2]。其中，酸性蛋白酶主要用于調(diào)味品及傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)[3-4]，如在干酪制作過(guò)程中酸性蛋白酶催化酪蛋白沉淀這一關(guān)鍵步驟常常作為干酪品質(zhì)好壞的指標(biāo)之一；中性蛋白酶主要用于醬油脫苦[5]、啤酒釀造[6]方面，如在醬油發(fā)酵過(guò)程，中性蛋白酶可以有效地水解蛋白質(zhì)原料，利用中性蛋白酶修飾作用去除水解產(chǎn)物的苦味；堿性蛋白酶主要用于皮革加工、食品烘焙、肉類軟化等方面[7]，如在面包制作過(guò)程中加入一定量的堿性蛋白酶能夠有效提高面團(tuán)的延伸性和韌性，增強(qiáng)面包起泡性[8]。

2 金屬離子作用微生物蛋白酶相關(guān)研究

國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)添加少量的金屬離子對(duì)于蛋白酶活性有顯著提高，其中以二價(jià)金屬離子為主。并且在不同來(lái)源蛋白酶樣品中添加同種金屬離子其作用效果與蛋白酶最適pH 及其活性部位結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，根據(jù)最佳pH 與活性位點(diǎn)的差異微生物蛋白酶被分為天冬氨酰基蛋白酶 （酸性）、金屬蛋白酶（中性）、半胱氨酸或巰基蛋白酶（堿性）和絲氨酸蛋白酶（堿性）。根據(jù)近幾年國(guó)內(nèi)外關(guān)于金屬離子作用微生物蛋白酶的相關(guān)研究結(jié)果表明：部分金屬離子對(duì)微生物蛋白酶具有明顯的激活作用，同種金屬離子對(duì)于不同來(lái)源的蛋白酶作用效果不同，不同添加量的作用效果也具有明顯差異。

表1 微生物蛋白酶主要來(lái)源Table1 Production strain of microbial protease

2.1 金屬離子對(duì)微生物酸性蛋白酶的影響及機(jī)理研究

微生物酸性蛋白酶主要來(lái)源于曲霉屬，其最適反應(yīng)pH 值主要在2.0～4.0。微生物酸性蛋白酶的活性位點(diǎn)一般為天冬氨?；?，在所有的蛋白酶中天冬氨酸型蛋白酶的反應(yīng)機(jī)制最為含糊不清，且沒(méi)有簡(jiǎn)單的化學(xué)模式作為指導(dǎo)，然而可以確定的是天冬氨酸型蛋白酶的催化活性與兩個(gè)天冬氨酸殘基有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，部分金屬離子能與酸性蛋白酶活性位點(diǎn)的殘基發(fā)生反應(yīng)從而改變酸性蛋白酶活性。表2歸納了國(guó)內(nèi)、外近6年關(guān)于金屬離子作用微生物酸性蛋白酶的研究，包括酸性蛋白酶的來(lái)源、最適pH 值、金屬離子添加量及其作用效果等內(nèi)容。

2.1.1 金屬離子激活酸性蛋白酶機(jī)理研究 從表2可以看出Cu2+、Mn2+和Fe2+對(duì)酸性蛋白酶活性影響最為顯著，在大部分研究中Mn2+對(duì)于酸性蛋白酶主要表現(xiàn)為激活作用，Lee 等[14]的研究中添加1 mmol/L 的Mn2+使米曲霉LK-101 的酸性蛋白酶相對(duì)酶活高達(dá)197%，添加1 mmol/L 的Cu2+后酸性蛋白酶相對(duì)酶活達(dá)到184%。Yin 等[11]的研究中添加10 mmol/L 的Fe2+后，酸性蛋白酶相對(duì)酶活高達(dá)225%。從作用機(jī)理來(lái)看，Mn2+提高酸性蛋白酶活性的機(jī)理主要是Mn2+參與了酸性蛋白酶分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，防止其在催化反應(yīng)過(guò)程中構(gòu)象的變化，從而提高了反應(yīng)速率，所以Mn2+常常作為酸性蛋白酶的穩(wěn)定劑[15]。Cu2+激活酸性蛋白酶活性的機(jī)理研究主要在于Cu2+可以和酸性蛋白酶活性中心的天冬氨酸殘基發(fā)生復(fù)雜的配體磷酸化反應(yīng)，從而改變酸性蛋白酶的構(gòu)象，天冬氨酸蛋白酶具有極其復(fù)雜的催化機(jī)制，這種通過(guò)變構(gòu)而提高酶活的發(fā)現(xiàn)在Ida 等[16]和Karsten[17]的研究中得到了驗(yàn)證。在很多研究報(bào)道中證明一定濃度的Fe2+對(duì)于酸性蛋白酶具有刺激作用，而作用機(jī)理尚不明確。王習(xí)文等[18]在金屬離子對(duì)漆酶活性影響的相關(guān)研究中提及添加一定濃度的Fe2+能夠提高漆酶活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Fe2+主要是通過(guò)與底物催化氧化產(chǎn)物ABTS·的反應(yīng)來(lái)影響漆酶的活性，這一研究結(jié)果給Fe2+激活蛋白酶活性提供了一定的啟示。然而，F(xiàn)e2+對(duì)于不同菌株所產(chǎn)酸性蛋白酶作用效果不一致，比如在表2中方春玉[12]和張秀春[13]的研究結(jié)果表明Fe2+對(duì)酸性蛋白酶起抑制作用。

表2 金屬離子作用微生物酸性蛋白酶研究Table2 Study on the effect of metal ions on microbial acid protease

2.1.2 金屬離子抑制酸性蛋白酶機(jī)理研究 大部分重金屬離子如Ag+、Hg2+和Fe3+等對(duì)酸性蛋白酶活性產(chǎn)生明顯的抑制作用。Sawada 等[19]對(duì)金屬離子作用擬青霉酸性蛋白酶進(jìn)行研究，結(jié)果表明Hg2+對(duì)酸性蛋白酶活性高度抑制。關(guān)于金屬離子抑制酸性蛋白酶活性的機(jī)理在曹志云等[20]的研究中獲得解釋，金屬離子如Cd2+、Pb2+及Hg2+能與酸性蛋白酶中的功能蛋白質(zhì)結(jié)合，占據(jù)酶的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白酶失活；除占據(jù)酶的活性位點(diǎn)，其抑制機(jī)理可能還與金屬離子結(jié)合酶的活性基團(tuán)有關(guān)。

2.2 金屬離子對(duì)微生物中性蛋白酶的影響及機(jī)理研究

微生物中性蛋白酶一般來(lái)源于曲霉屬和芽孢桿菌屬，其最適反應(yīng)pH 值主要在6.5～7.5。微生物中性蛋白酶大部分屬于金屬蛋白酶，其中主要為活性部位含鋅的蛋白酶，還有一些是含有兩種金屬離子的蛋白酶。金屬離子與3 個(gè)保守氨基酸殘基結(jié)合，這些氨基酸通常為組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或賴氨酸。還有一部分中性蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，這部分蛋白酶主要是以絲氨酸?；孽；?酶作為催化機(jī)制。表3主要?dú)w納了近3年國(guó)內(nèi)、 外關(guān)于金屬離子及其添加量對(duì)不同來(lái)源中性蛋白酶活性影響的研究。

表3 金屬離子作用微生物中性蛋白酶的研究Table3 Study on the effect of metal ions on microbial neutral protease

2.2.1 金屬離子激活中性蛋白酶機(jī)理研究 在中性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究中，Ca2+往往表現(xiàn)為明顯激活作用，其影響機(jī)理主要是中性蛋白酶往往不耐高溫，Ca2+能夠維持中性蛋白酶的空間構(gòu)象，提高中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性，從而提高蛋白酶活性，因此Ca2+常常作為穩(wěn)定劑添加到蛋白酶中。Zn2+對(duì)于部分中性蛋白酶起激活作用，激活機(jī)理往往是這部分中性蛋白酶活性部位不含Zn2+，Zn2+能通過(guò)疏水鍵結(jié)合、 金屬結(jié)合和離子相互作用等方式提高中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性，從而提高中性蛋白酶活性[26]。如枯草桿菌中性蛋白酶就是一種金屬含鋅酶，其活性中心含一個(gè)Zn2+[27]，Zn2+作為酶的催化活性中心，它對(duì)維持酶的活性及其活性部位構(gòu)象具有重要作用，而在大部分研究中添加Zn2+往往表現(xiàn)為抑制作用。Mg2+對(duì)于大部分菌株所產(chǎn)的中性蛋白酶起激活作用，激活機(jī)理主要是Mg2+置換了中性金屬蛋白酶活性部位的部分Zn2+，改變了蛋白酶活性位點(diǎn)微環(huán)境，這種改變有利于中性蛋白酶活性的提高[28]。另一種原因則是Mg2+與中性蛋白酶結(jié)構(gòu)中除活性位點(diǎn)外的其它氨基酸附著點(diǎn)相結(jié)合，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵，從而提高相應(yīng)的酶活[29]。K+和Li+對(duì)中性蛋白酶的作用機(jī)理與此機(jī)理相似，都是與保守氨基酸殘基結(jié)合并參與催化反應(yīng)，提高中性蛋白酶催化效率。

2.2.2 金屬離子抑制中性蛋白酶機(jī)理研究 表3中Zn2+對(duì)中性蛋白酶活性主要起抑制作用，其抑制機(jī)理為大部分中性蛋白酶屬于金屬蛋白酶，其活性中心含有Zn2+，添加過(guò)量Zn2+往往會(huì)抑制中性蛋白酶活性，這與很多文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符[30]；研究發(fā)現(xiàn)部分金屬離子能替代中性蛋白酶活性部位的金屬離子，這種替代反應(yīng)造成了活性部位結(jié)構(gòu)的不利改變，從而抑制其活性[31]；高濃度的Fe3+、Ge2+和Co2+等重金屬離子能與反應(yīng)體系螯合或與蛋白酶發(fā)生反應(yīng)，破壞蛋白酶空間結(jié)構(gòu)，致使蛋白酶活性顯著抑制，甚至失活。胡皆漢[32]在研究枯草桿菌中性蛋白酶與Co（Ⅱ）相互作用的核磁共振譜中發(fā)現(xiàn)，枯草桿菌中性蛋白酶活性中心的Zn（Ⅱ）與外加的Co（Ⅱ）存在直接相互作用，Co（Ⅱ）部分置換原酶活性中心的Zn（Ⅱ），形成“Co-NP”酶衍生物，影響酶的催化活性。

2.3 金屬離子對(duì)微生物堿性蛋白酶影響研究

微生物堿性蛋白酶來(lái)源較廣，其最適反應(yīng)pH值主要在8.0～12.0。微生物堿性蛋白酶活性位點(diǎn)有半胱氨酸、巰基和絲氨酸，其中以絲氨酸為主，故堿性蛋白酶又稱為絲氨酸蛋白酶。絲氨酸蛋白酶由絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）和天冬氨酸（Asp）組成的催化三元體所表征。它們按照Ser-His，His-Asp 成對(duì)起作用。以第2 個(gè)組氨酸代替天冬氨酸揭示了天冬氨酸的輔助性質(zhì)，所有催化步驟都是由Ser-His 二元體完成。部分金屬離子能夠與堿性蛋白酶的活性位點(diǎn)殘基發(fā)生反應(yīng)，改變堿性蛋白酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致堿性蛋白酶活性發(fā)生改變。表4中針對(duì)近6年國(guó)內(nèi)、外關(guān)于金屬離子作用微生物堿性蛋白酶活性的相關(guān)研究進(jìn)行了歸納。

表4 金屬離子作用微生物堿性蛋白酶的研究Table4 Study on the effect of metal ions on microbial alkali protease

2.3.1 金屬離子激活堿性蛋白酶機(jī)理研究 枯草桿菌堿性蛋白酶屬于絲氨酸型蛋白酶家族，其活性位點(diǎn)具有一個(gè)絲氨酸關(guān)鍵殘基，此殘基是天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸催化三元體的一部分，枯草

3 總結(jié)與展望

金屬離子提高蛋白酶活性的機(jī)理可分為三大類。第一類主要是提高蛋白酶穩(wěn)定性，包括熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。金屬離子特別是二價(jià)金屬離子與蛋白酶分子中的基團(tuán)發(fā)生聯(lián)結(jié)形成金屬鍵，對(duì)維持蛋白酶空間構(gòu)型方面起到一定穩(wěn)定作用。金屬離子還能有效促進(jìn)蛋白酶分子鏈內(nèi)和鏈間的氫鍵作用及肽鏈的穩(wěn)定折疊或部分折疊狀態(tài)。第二類主要是金屬陽(yáng)離子通過(guò)與除活性位點(diǎn)外的其它氨基酸附著點(diǎn)相結(jié)合來(lái)提高蛋白酶活力。金屬離子通過(guò)與內(nèi)源和外源配體配位，形成金屬活性部位，這部分金屬離子常常作為激活劑使用，其中最常見(jiàn)的金屬離子是Zn2+，其次是Co2+、Mn2+和Cu2+。第三類是金屬離子在催化反應(yīng)過(guò)程中傳遞電子，進(jìn)行親電或者親核攻擊，促進(jìn)酶和底物的結(jié)合等作用。

筆者曾從霉豆瓣中分離得到一株高產(chǎn)蛋白酶的菌株，在研究其酶學(xué)特征過(guò)程中發(fā)現(xiàn)添加微量的Mn2+和Cu2+對(duì)其酶活有顯著提高，且與對(duì)照組相比表現(xiàn)出明顯的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，從而大大縮短了發(fā)酵周期。在低溫條件下，筆者發(fā)現(xiàn)添加Mn2+和Cu2+的試驗(yàn)菌株其生長(zhǎng)速率和蛋白酶活性都比對(duì)照組表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。目前很多傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)仍處于落后階段，其發(fā)酵過(guò)程處于開(kāi)放式環(huán)境，季節(jié)變化對(duì)實(shí)際生產(chǎn)影響較大。一年中霉豆瓣的生產(chǎn)主要在6月～8月，環(huán)境溫度低于28 ℃將會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期，增加生產(chǎn)成本。針對(duì)金屬離子能在低溫條件下提高酶活和生長(zhǎng)速率這一特性，若將其運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)于企業(yè)提高生產(chǎn)效率和節(jié)約生產(chǎn)成本具有重要意義。筆者在Cu2+激活米曲霉蛋白酶活性機(jī)理的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Cu2+激活蛋白酶活性主要與蛋白酶等電點(diǎn)、 氨基酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。在研究Cu2+激活蛋白酶機(jī)理過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)純化所得的蛋白酶量較少，酶活損耗較大，從而增加了試驗(yàn)難度，優(yōu)化層析方法有助于解決這一難題。目前國(guó)內(nèi)、外對(duì)于金屬離子影響蛋白酶活性的機(jī)理研究尚處于初級(jí)階段，仍需要進(jìn)一步探索。深入研究金屬離子激活蛋白酶活性的機(jī)理為今后研究蛋白酶催化機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，更為今后闡明蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供理論依據(jù)。桿菌蛋白酶家族至少有一個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)，這使得它們具有良好的熱穩(wěn)定性[39]。在多位學(xué)者[40-41]的研究中，Ca2+、Mn2+和Mg2+對(duì)來(lái)自芽孢桿菌屬產(chǎn)生的堿性蛋白酶活性都有明顯提高，其中Ghorbel[42]從蠟狀芽孢桿菌BG1 中分離純化得到堿性蛋白酶，分別添加5 mmol/L Ca2+、Mg2+和Mn2+作用后蛋白酶相對(duì)酶活達(dá)到450%、285.5%和157.5%。Ca2+、Mn2+和Mg2+提高堿性蛋白酶酶活的國(guó)內(nèi)、 外相關(guān)報(bào)道[42-43]有很多，而關(guān)于其影響機(jī)理的研究甚少。Ca2+對(duì)大多數(shù)堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性具有明顯的增強(qiáng)作用[44]，研究認(rèn)為Ca2+提高堿性蛋白酶活性的機(jī)理主要是在一定溫度條件下Ca2+能夠保護(hù)堿性蛋白酶不發(fā)生熱變性，且在高溫情況下也能避免其構(gòu)象發(fā)生改變[45]。在絲氨酸蛋白酶空間結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)其活性部位含有兩個(gè)鈣的結(jié)合位點(diǎn)，去除強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)上的一個(gè)鈣離子將使蛋白酶熱穩(wěn)定性顯著下降[46]，進(jìn)一步驗(yàn)證了Ca2+對(duì)于堿性蛋白酶熱穩(wěn)定性方面具有重要作用。對(duì)于Mn2+和Mg2+影響堿性蛋白酶活性的機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)，Mn2+和Mg2+能與堿性蛋白酶分子中的側(cè)鏈氨基酸殘基結(jié)合，并在不改變堿性蛋白酶催化構(gòu)象的基礎(chǔ)上穩(wěn)定堿性蛋白酶的分子構(gòu)象，調(diào)節(jié)堿性蛋白酶活性。然而，大量研究中發(fā)現(xiàn)Mg2+對(duì)于不同來(lái)源的堿性蛋白酶作用效果往往表現(xiàn)出較大差異，其原因可能與不同堿性蛋白酶氨基酸序列及其高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。對(duì)于Na+和K+提高堿性絲氨酸蛋白酶活性機(jī)理，除在Wang[47]的文獻(xiàn)中提及與蛋白酶穩(wěn)定性有關(guān)外，暫無(wú)其它報(bào)道。因此Na+和K+提高蛋白酶活性的機(jī)理可能是增強(qiáng)了堿性蛋白酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。Becker[48]的研究也證實(shí)了堿性蛋白酶在室溫條件下堿金屬鹵化物、 堿金屬磷酸鹽和堿金屬碳酸鹽等的加入能夠增強(qiáng)堿性蛋白酶的穩(wěn)定性，其中以氯化鈉效果最為顯著。

2.3.2 金屬離子抑制堿性蛋白酶機(jī)理研究 重金屬抑制堿性蛋白酶活性的文獻(xiàn)報(bào)道較多，主要是金屬汞、鎘、鉛等與堿性蛋白酶分子中的巰基反應(yīng)將其轉(zhuǎn)換為硫醇，或者是與堿性蛋白酶中的組氨酸和色氨酸殘發(fā)生反應(yīng)，從而抑制酶的活性。此外，通過(guò)銀和汞的作用可將堿性蛋白酶分子中的二硫鍵通過(guò)水解的方式降解[49]。這些不可逆反應(yīng)的發(fā)生使得堿性蛋白酶活性降低或徹底失活。