張慧恩 王彩霞 楊 華*

（1 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 浙江寧波315100 2 寧波御坊堂生物科技有限公司 浙江寧波315100）

新鮮度是水產(chǎn)品的重要評價指標(biāo)，目前衡量水產(chǎn)品新鮮度最常用的指標(biāo)是K 值。K 值是以水產(chǎn)品體內(nèi)核苷酸在降解過程中產(chǎn)生的一系列化合物作為指標(biāo)的鮮度判定方法[1]?；铙w水產(chǎn)品的肌肉運動和生理代謝都需要來自三磷酸腺苷（ATP）轉(zhuǎn)化提供的能量，而水產(chǎn)品死后其體內(nèi)所含的ATP在酶和微生物的共同作用下會降解為二磷酸腺苷（ADP）、腺苷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）、次黃嘌呤核苷（HxR）和次黃嘌呤（Hx）[2]。K 值就是次黃嘌呤核苷（HxR）、次黃嘌呤（Hx）量之和與ATP 及降解產(chǎn)物總量的百分比[3]。K 值的大小，能反映魚體在死亡至自溶階段的新鮮程度，是水產(chǎn)品質(zhì)評價的重要鮮度指標(biāo)[4-5]。準(zhǔn)確測定水產(chǎn)品中ATP 關(guān)聯(lián)化合物對水產(chǎn)品的鮮度評價具有重要意義。

目前，K 值的測定方法主要通過各種分離手段，測定樣品中各ATP 關(guān)聯(lián)化合物的含量。常見的分離手段有毛細管電泳法[6-7]、離子色譜法[8]、反相高效液相色譜法[9-10]等。毛細管電泳對ATP 關(guān)聯(lián)化合物的分辨率較高，而儀器昂貴；離子色譜法在分離過程中分離柱需要長時間平衡，分析時間長；反相高效液相色譜法具有操作簡單，儀器普及等優(yōu)點，如水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3048-2014 魚類鮮度指標(biāo)K 值的測定就是用反相高效液相色譜法測定，然而傳統(tǒng)的反相高效液相色譜法分離核苷酸種類有限，特別是對ATP 關(guān)聯(lián)化合物分析測定時，往往各組分之間的分離度較低，達不到完全分離的效果。目前，也有研究在反相高效液相色譜法中引入離子對試劑以提高分離效果[11-12]，然而離子對試劑的引入極易污染色譜柱，對色譜柱損耗較大，流動相平衡時間長，特別影響分析結(jié)果的重現(xiàn)性。而親水性色譜（HILIC）能夠增強極性物質(zhì)在色譜中保留，從而提高分離效果[13]。親水性色譜通過強極性固定性，結(jié)合高比例有機相/低比例水相組成的流動相來實現(xiàn)極性化合物的分離。傳統(tǒng)的反相色譜對強極性和親水性的小分子物質(zhì)的保留和分離能力較弱，通常流動相需要采用高比例的水相才能實現(xiàn)其保留，然而高比例的水相會導(dǎo)致一系列問題，比如固定相鍵合基團的脫落和反浸潤。親水性色譜對親水性化合物有較強的保留能力，對親水性化合物和極性化合物有廣泛的選擇性[14]。非常適用于分離測定ATP 關(guān)聯(lián)化合物這類極性化合物。本研究利用親水性色譜，建立了水產(chǎn)品中6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀鯧（Pampus argenteus），寧波路林市場，-80℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品ATP、ADP、AMP、Hx、HxR、IMP，源葉生物；乙腈為Merck 色譜純；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、高氯酸、氫氧化鉀（均為分析純級），國藥集團。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695 高效液相色譜儀；Waters 2998二極管陣列檢測器；JY92-ⅡDN 超聲波細胞粉碎機，寧波新芝；QL-861 漩渦振蕩儀，海門其林貝爾；冷凍離心機（eppendorf 5810R），艾本德公司；天平（Sartorius BSA124S），賽多利斯公司；pHS-3E pH 計，上海雷磁；色譜柱 BEH Amide（4.6 mm×250 mm，5 μm），Waters 公司；Athena C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），安譜實驗科技公司。

1.3 樣品處理

將魚背脊上的去皮魚肉均質(zhì)后，取2.00 g，放入50 mL 離心管中，加入預(yù)冷的20 mL 高氯酸溶液（10%），渦旋混勻，冰浴超聲裂解提取5 min。在4 ℃下離心8 000 r/min，10 min，取出上清液。再用10 mL 高氯酸溶液（10%）提取沉淀物，離心，合并上清液，用KOH 溶液將其中和至pH 6.5。先用10 mol/L KOH 溶液，接近至所需的pH 時，改用1 mol/L 的KOH 溶液，用流動相定容至50 mL，在4℃下離心8 000 r/min，15 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，待測。

1.4 色譜條件

反相色譜分析條件：色譜柱Athena C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/L 磷酸二氫鉀和0.02 mol/L 磷酸氫二鉀（1 ∶1）用磷酸調(diào)節(jié)至pH 6.0；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃，檢測波長：254 nm。親水性色譜分析條件：色譜柱BEH Amide （4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：A 2.0 mmol/L 磷酸二氫鉀，B 乙腈，等度洗脫，A 20%，B 80%，流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃，檢測波長：254 nm。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線

用流動相配制標(biāo)準(zhǔn)系列混標(biāo)溶液，每種標(biāo)樣的濃度梯度為5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 μmol/L，進樣量10 μL，測定分析，根據(jù)保留時間定性，以峰面積與標(biāo)樣濃度做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.6 數(shù)據(jù)處理

式中，M——樣品中ATP、ADP、AMP、Hx、HxR、IMP 含量（μmol/g）；C——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上計算得到的樣品中ATP、ADP、AMP、Hx、HxR、IMP含量（μmol/L）；V——樣品定容體積（L）；m——稱取的樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理方法

從食品或生物樣品中提取ATP 關(guān)聯(lián)化合物，最常用的方法是高氯酸提取[15]。我國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3048-2014 魚類鮮度指標(biāo)K 值的測定也選用此法，這是因為樣品中的蛋白質(zhì)在高氯酸中能夠很好的沉淀，減少蛋白質(zhì)對分析的干擾。然而，加入高氯酸后，樣品易形成塊狀不溶物，導(dǎo)致ATP關(guān)聯(lián)化合物不能完全釋放出來。采用冰浴超聲可使塊狀不溶物迅速分散，保證提取的目標(biāo)物充分進入溶液中，提取液用KOH 中和后，4 ℃低溫放置2 h 可促進高氯酸鉀析出，4 ℃下8 000 r/min，離心15 min 可將高氯酸鉀沉淀去除。

2.2 色譜柱對分離效果的影響

通過反相色譜柱對6 種化合物進行分離，色譜條件參考水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3048-2014，其中流動相為0.02 mol/L 磷酸緩沖溶液pH 6.0。由于ATP 關(guān)聯(lián)化合物基本都帶有磷酸基團，結(jié)構(gòu)相似，極性較大，反相色譜柱未能對幾種物質(zhì)進行分離，見圖1。其中ATP 與IMP、Hx 與AMP 分離度均未達到1.5。流動相中不含有機相組分，這對反相色譜柱的使用和維護是非常不利的，在高水相的使用條件下色譜柱填料容易發(fā)生化學(xué)鍵合基團的失效甚至脫落，單一流動性的使用也使色譜分離過程中流動相的作用被忽視，如在傳統(tǒng)反相色譜系統(tǒng)的流動相中加入少量有機相（如甲醇或乙腈），將加大流動相的洗脫能力，會使保留時間進一步減小，物質(zhì)之間的分離效果將更差。

親水性色譜柱因為固定相有極性官能團修飾（如氨基、酰胺基等），所以對極性化合物保留強，適合分離多肽、糖、核酸等物質(zhì)[16]。通過親水性色譜柱對6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物進行分離，結(jié)果見圖2。親水性色譜對6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物進行了較好的分離，與反相色譜相比，各物質(zhì)的出峰順序發(fā)生了變化，這是由于親水色譜與反相色譜的分離機理不同，在反相色譜中增大有機相比例，洗脫能力增強，而在親水色譜中要增大水相比例，洗脫能力才增強。在親水色譜中ATP 的出峰最慢并且有些拖尾，這是由于ATP 分子帶有的磷酸基團最多，極性最強，親水色譜對其保留性最強，各物質(zhì)的分離度均大于1.5。

2.3 磷酸二氫鉀濃度的影響

親水性色譜在分離時只使用單一成分的磷酸二氫鉀，而不用配制磷酸緩沖溶液，試驗中分別配制了2.0，4.0，6.0，8.0 mmol/L 的磷酸二氫鉀溶液，流動相為磷酸二氫鉀溶液20%，乙腈80%。結(jié)果顯示，磷酸二氫鉀濃度主要影響ATP 的峰形，對其它5 種物質(zhì)的出峰時間和峰形影響不大，隨著磷酸二氫鉀濃度的增加，ATP 的出峰時間提前，峰形更差，拖尾嚴(yán)重。這可能是因為隨著磷酸二氫鉀濃度的增加，流動相中的離子強度增加，進一步抑制了ATP 分子與固定相之間的作用，從而使固定相對其保留能力減弱。因此，選擇2.0 mmol/L 的磷酸二氫鉀溶液作為流動相。

2.4 流動相中乙腈比例的影響

色譜常用流動相中乙腈與甲醇相比具有更小的紫外吸收，最適宜用于紫外檢測器。在相同情況下，使用乙腈的柱壓也小于甲醇，這有利于色譜柱的長期正常使用。而且甲醇是質(zhì)子型試劑，在分離過程中能與ATP 關(guān)聯(lián)物分子中的極性基團形成氫鍵，從而降低固定相對物質(zhì)的保留作用，而乙腈是非質(zhì)子型試劑，不會與分析物形成氫鍵[17]。試驗比較了乙腈與2.0 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液的比例分別為95∶5，90∶10，80∶20，70∶30 情況下，對分析測定的影響。結(jié)果顯示，不同比例的流動相對各組分的峰面積影響不大，只對出峰時間有影響，親水色譜中流動相的洗脫能力隨著水相比例的增大而加強，2.0 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液比例小于10%（體積比）時，色譜的出峰時間顯著延長，因此本試驗選用乙腈與2.0 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液的比例為80∶20，可以使樣品在20 min 內(nèi)完成分析，各組分的峰型也基本良好。

圖1 反相色譜分析色譜圖Fig.1 Chromatogram of Reversed phase HPLC

圖2 親水色譜分析色譜圖Fig.2 Chromatogram of HILIC HPLC

圖3 8.0 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of mobile phase containing 8.0 mmol/L KH2PO4

2.5 線性關(guān)系、檢出限及定量限

試驗考察了6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物在一定濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)。以6 種化合物的摩爾濃度（x，μmol/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，同時以色譜峰的信噪比（S/N）大于3 時為方法檢出限，（S/N） 大于10 時為定量限，結(jié)果見表1。由表1可以看出6 種物質(zhì)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.9950。

表1 回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table1 Regression equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits

2.6 精密度與回收率

將標(biāo)準(zhǔn)品加入到2.0 g 樣品中，各配制成3 個濃度梯度的加標(biāo)量，進行樣品提取和色譜分析，每個加標(biāo)量做6 個平行，計算回收率。由表2可見，6種物質(zhì)的平均回收率在82.0%～108.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.8%～6.4%，保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.5%～2.0%。說明本方法重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度較好。

2.7 水產(chǎn)品中ATP 關(guān)聯(lián)化合物的測定

應(yīng)用本方法對不同保藏溫度下的銀鯧中ATP關(guān)聯(lián)化合物進行測定。結(jié)果見圖4、圖5和表3。

根據(jù)K 值計算公式：

銀鯧4 ℃保藏10 d，K 值78.4%，-40 ℃保藏10 d，K 值16.5%。一般認(rèn)為即殺魚的K 值在10%以下，新鮮魚K 值大約在20%以下，20%～40%為二級鮮度，60%～80%為初期腐敗魚[3]。-40 ℃保藏10 d 的銀鯧K 值16.5%為新鮮魚，4 ℃保藏10 d的K 值78.4%已處于初期腐敗。魚體死后肌肉組織中的三磷酸腺苷（ATP）的降解途徑是三磷酸腺苷 （ATP）→二磷酸腺苷 （ADP）→單磷酸腺苷（AMP）→肌苷酸（IMP）→次黃嘌呤核苷（HxR）→次黃嘌呤（Hx）。從測定圖譜和結(jié)果上可見，兩種保藏條件下的銀鯧在IMP 含量上的差異，比其它5種物質(zhì)更加明顯，這是因為AMP 在脫氨酶作用下，脫氨形成肌苷酸（IMP），而IMP 形成后的降解過程相對緩慢，而且降解速度直接受肌肉保存溫度的影響[18]。-40 ℃的保藏溫度顯著降低了魚肉中IMP 的降解過程。

表2 加標(biāo)回收率和精密度 （n=6）Table2 Determination results of sample and recoveries （n=6）

圖4 4 ℃保藏10 d 銀鯧中ATP 關(guān)聯(lián)化合物Fig.4 HPLC chromatogram of Pampus argenteus preserved in 4 ℃for 10 days

圖5 -40 ℃保藏10 d 銀鯧中ATP 關(guān)聯(lián)化合物Fig.5 HPLC chromatogram of Pampus argenteus preserved in -40 ℃for 10 days

表3 不同保藏條件下的銀鯧ATP 關(guān)聯(lián)化合物含量（n=3）Table3 Determination of ATP related compounds in Pampus argenteus under different preservation conditions （n=3）

3 結(jié)論

以乙腈-2.0 mmol/L 磷酸二氫鉀為流動相，用BEH Amide 親水性色譜柱，在254 nm 處對6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物進行分離，與C18 反相色譜柱測定相比分離效果更優(yōu)。在親水性色譜中極性化合物更易被保留，流動相的洗脫能力隨著水相比例的增加而增加，6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物的出峰順序與C18 反相色譜體系不同，依次是次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷、單磷酸腺苷、肌苷酸、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷。本方法6 種ATP 關(guān)聯(lián)化合物保留時間RSD 為0.5%～2.0%，峰面積RSD 為0.8%～6.4%，3個濃度梯度加標(biāo)回收率在82.0%～108.2%，表明本方法重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度較好，是一種可靠性、實用性強的測定方法。