鄭振霄 戴志遠，2* 沈 清，2 宋恭帥 過雯婷 薛 靜，2

（1 浙江工商大學海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室 杭州310012）

DHA（二十二碳六烯酸）和EPA（二十碳五烯酸）是n-3 系列多不飽和脂肪酸（PUFA）的重要組成成員，在它們的結構中分別有6 個和5 個不飽和雙鍵，對人體的健康起到重要調節(jié)作用。從DHA、EPA 的發(fā)現(xiàn)到應用，經歷了上百年的探索。19 世紀末期，Heyerdahl[1]提出鱈魚肝油的保健作用是由n-3PUFA（多不飽和脂肪酸）引起的，并且他建議給它們命名為“治療的酸”，這是人類早期研究DHA、EPA 的典型代表。第二次世界大戰(zhàn)后，Notevarp[2]指出DHA、EPA 與心血管疾病的發(fā)病率有著密切的聯(lián)系。20 世紀70年代，丹麥科學家Bang 和Dyerberg[3]發(fā)現(xiàn)常食用魚類、海獸或魚油的愛斯基摩人的心肌梗塞、 中風等心腦血管疾病的發(fā)病率明顯較低，通過調查分析得出愛斯基摩人心腦血管疾病發(fā)病率低的主要原因是攝入的海洋動物的長鏈不飽和脂肪酸較多。這份詳細的研究報告掀起了現(xiàn)代人對DHA、EPA 的研究熱潮。20世紀90年代，日本學者制備了高純度的n-3PUFA，并開始將其應用于動脈硬化癥與高血脂的治療中[4]。21 世紀以來，隨著分子生物學及臨床醫(yī)學的快速發(fā)展，DHA、EPA 在體內的作用機制逐步被揭示，以DHA、EPA 為主要成分的保健食品正走進更多的家庭，在人類生活中扮演著越來越重要的角色。DHA、EPA 是人體必需的n-3PUFA，對人體的正常生理功能起重要作用。研究表明，DHA和EPA 的生理功效主要有：①抗血小板凝聚，減少血栓形成，防治心肌梗塞；②降血脂，預防和治療動脈粥樣硬化；③抗炎癥；④抑制腫瘤生長；⑤促進嬰幼兒大腦的生長發(fā)育，預防老年癡呆，保護視力[5-12]等。雖然DHA 和EPA 的結構類似，但這兩種物質的功能并不完全相同。DHA 主要對神經系統(tǒng)的調節(jié)作用比較大，EPA 則對心血管疾病的預防具有重要作用[13]。對DHA 和EPA 進行分離、純化，制備出高純度的DHA 和EPA 制劑，有很重要的現(xiàn)實意義。近年來，隨著人們對魚油中DHA、EPA 保健功能認識的不斷深入，魚油的市場銷售價格也迅速增加，圖1為1986-2014年魚油價格變動趨勢圖。開發(fā)利用魚油資源，制備富含DHA、EPA 的魚油保健品，具有重要的商業(yè)價值。

圖1 1986-2014年魚油價格變動趨勢圖Fig.1 The price tendency of fish oil in the year of 1986 to 2014

DHA、EPA 分離純化的傳統(tǒng)理化方法有低溫結晶法、分子蒸餾法、尿素包合法、超臨界流體萃取法。低溫結晶法雖工藝簡單，操作方便，但需要回收大量的有機溶劑，且分離效率不高。曾曉雄等[14]做了大量的低溫結晶法試驗，所得EPA 和DHA 含量為40%左右。分子蒸餾法是利用混合物組分的揮發(fā)度不同而進行分離[15]。饒華俊[16]采用五級分子蒸餾分離魚油原料，得到DHA+EPA＞60%的DHA 和EPA 粗品，然而，分子蒸餾需要高真空的設備，能耗較高，因此可以采取其它方法預處理后再用分子蒸餾方法。尿素包合法所需設備簡單、操作成本低，然而該法需回收大量溶劑，產品純度受到一定限制。朱世云等[17]討論了不同脲包客體及溶劑種類對尿素包合物形成的影響。李國文[18]在1997年詳細論述了尿包試驗的路徑及條件。硝酸銀絡合法雖可以制備出高純度的DHA、EPA 單品，但硝酸銀價格昂貴，回收率低，所以暫時只停留在實驗室階段。趙亞平[19]將含有EPA 和DHA 的乙酯化魚油與硝酸銀水溶液混合，結果有90%以上EPA 和DHA 與油相分離。陶遵威[20]采用硝酸銀法也制備出純度超過95%的DHA+EPA 的產品。超臨界CO2萃取法通常對儀器設備的要求較高，并且超臨界流體的生產代價較高，不利于大規(guī)模生產?？傊瑐鹘y(tǒng)的物理化學法富集EPA 和DHA，其條件通常為高溫、高壓或者特殊的pH，這些會造成EPA、DHA 全順式構型異構化、 雙鍵移位或聚合，并且操作成本高、消耗能量大，這些均不利于其應用于工業(yè)化生產并且在生產過程易發(fā)生副反應，產生對人體有害的物質[21-23]。

脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶，作為生物催化劑不但可以催化油酯的水解反應，還能在酯合成和酯交換反應中發(fā)揮重要作用。研究表明[24]，細菌的28 個屬、放線菌的4 個屬、酵母菌的10 個屬、其它真菌的23 個屬的微生物都可以產生脂肪酶，不同來源的脂肪酶適合催化的反應類型不同，相應地對DHA 和EPA 的富集效果也不同[25]。一般在研究初期，需要根據選定的反應類型，結合現(xiàn)有的資料對脂肪酶進行篩選。目前已報道具有良好選擇性的脂肪酶有來源于褶皺假絲酵母（Candida rugosa）、念珠地絲菌（Geotrichum candidum）等的脂肪酶，這些脂肪酶可以較好地保留2 位上的n-3PUFA，水解飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，故可以用來作為水解法富集DHA 和EPA 的催化劑[26]。酶法富集DHA、EPA 被認為是一種很有潛力的方法，因為酶富集方法的反應條件溫和，具有高效性以及高度的專一性，可以有效降低氧化以及異構化的發(fā)生[27-28]。酶法生產的產品具有良好的感官特性，是生產制造保健食品和藥品的優(yōu)良來源。此外，酶法生產過程中的廢棄物容易被微生物降解，生產產生的廢水生物需氧量極低，有利于環(huán)境保護[29-30]。酶工程技術的快速發(fā)展為酶法生產DHA、EPA 提供了新的研究方法和研究思路，發(fā)酵罐培養(yǎng)技術、 固定化酶技術的發(fā)展降低了酶法生產DHA、EPA 過程中的生產成本，為酶法富集DHA、EPA 的工業(yè)化生產提供新的思路[31]。

本文介紹了不同類型脂肪酶在DHA、EPA 分離純化中的作用和應用，結合實例分析了酶工程技術在酶法擴大化生產DHA、EPA 的應用，以期為酶法生產DHA、EPA 的工業(yè)化生產提供參考。

1 脂肪酶的分類與應用

酶催化反應是一個比較溫和的過程，可以保證DHA 和EPA 的結構穩(wěn)定，同時催化又具有高度選擇性，這使得酶法在富集DHA 和EPA 方面有明顯優(yōu)勢。Bottino 等[32]研究表明，脂肪酶對酰基碳鏈的選擇性與魚油中n-3PUFA 對脂肪酶水解的“抵抗效應”有關。不飽和脂肪酸分子中存在碳碳雙鍵和全順式構型，這樣的分子結構會引起整個碳鏈的彎曲，因此在油酯分子上不飽和脂肪酸靠近酯鍵的最末端甲基對脂肪酶的“進攻”形成了空間阻礙。DHA 和EPA 分子中分別有6 個和5 個雙鍵，導致全順式構型的整個鏈高度彎曲，加強了這種空間阻礙作用，使得脂肪酶難以接觸到DHA和EPA 形成的酯鍵，故脂肪酶對DHA 和EPA 酰基作用較弱，不同脂肪酸在甘油酯中的構型見圖2。飽和與單不飽和脂肪酸在空間上對酶分子不存在這樣的空間阻礙，因而很容易被水解。酶法制備DHA 和EPA 的原理就是利用脂肪酶的這一特性[33]。目前，酶法制備DHA 和EPA 主要有選擇性水解反應、選擇性轉酯反應和選擇性酯化反應等。無論何種方式，都需要運用酶的選擇性來完成，依據其在反應過程中的作用不同可以分成三大類：DHA 專一性酶、EPA 專一性酶以及DHA、EPA 專一性酶。

圖2 不同脂肪酸在甘油酯中的構型[57]Fig.2 Configurations of different fatty acids in glycerides[57]

1.1 DHA 專一性酶

DHA 專一性酶是一種對DHA 具有選擇性，對除了DHA 以外的PUFA 及飽和、單不飽和脂肪酸沒有選擇性的脂肪酶，這類脂肪酶較為常見，多數脂肪酶都具有這種特性[34]。利用這種酶可以富集DHA，而富集其它脂肪酸的效果較差，比較典型的有褶皺假絲酵母脂肪酶，戴爾根霉（Rhizopus delemar）脂肪酶，黑曲霉（Aspergillus niger）脂肪酶，青霉菌（Penicillium camembertii）脂肪酶等。Halldorsson 等[35]研究了12 種商業(yè)脂肪酶在魚油醇解反應中的催化特性，得出大多數脂肪酶對飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸都具有較強的催化作用，而對n-3PUFA 具有對抗性的結論。就DHA 和EPA 來講，這些脂肪酶通常更傾向水解EPA，由于在DHA 結構中，碳碳雙鍵與羧基之間的距離要比EPA 近得多，如圖3所示。這增加了脂肪酶對DHA 作用的難度[36]。因此大多數脂肪酶都具有DHA 選擇性。Tannka 等[37]嘗試利用脂肪酶對魚油進行選擇性水解，從而將魚油DHA 富集在甘油酯中。他們發(fā)現(xiàn)在褶皺假絲酵母脂肪酶的水解作用下，甘油酯中的DHA 含量一直處于上升狀態(tài)，而EPA 含量先增加后減少，最后含量比原來魚油中的含量還低。產生這種現(xiàn)象的原因是褶皺假絲酵脂肪酶是一種對脂肪酸碳鏈有選擇性的酶，在催化中優(yōu)先水解飽和或單不飽和脂肪酸，使得n-3PUFA 的含量均有上升，水解到一定程度后，褶皺假絲酵母開始作用于n-3PUFA，由于該酶對EPA的水解作用更強一些，因此EPA 含量下降，而DHA 的含量一直在上升。Shimada 等[38]以金槍魚油在NaOH 乙醇體系中水解后得到的游離脂肪酸混合物作為反應底物，在戴爾根霉脂肪酶的催化下使飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸與月桂醇選擇性酯化，反應結束后，DHA 的收率達到84%，將未反應的脂肪酸萃取后再進行一次選擇性酯化，DHA 的純度可達89%，收率為71%。Seung 等[39]在實驗室規(guī)模填充床中進行了DHA 的連續(xù)富集反應。首先使金槍魚與NaOH 發(fā)生皂化反應，再做酸化處理，然后用正己烷萃取出上層油相中的脂肪酸，進一步用具有高度選擇性的戴爾根霉脂肪酶催化脂肪酸與乙醇發(fā)生酯化反應。研究發(fā)現(xiàn)隨著反應底物在填充床中停留時間的延長，DHA 的濃度逐漸上升，其回收率逐漸下降。產生這種現(xiàn)象的原因是戴爾根霉脂肪酶是一種DHA 選擇性酶，隨著反應的進行，其它脂肪酸比DHA 更容易發(fā)生酯化反應，使得游離脂肪酸中的DHA 得以富集。條件優(yōu)化的結果為：20 ℃，醇酸比5 ∶1，水含量1%的體系中，反應時間為90 min，產物中DHA 濃度達到70%，回收率達87%。DHA 專一性酶種類相對較多，且專一性強，大部分水產中的DHA 含量要高于EPA 含量，因此，利用DHA 專一性酶從水產及加工廢物中富集DHA 是制備DHA 產品的一條非常具有前景的途徑。

圖3 甘油酯中EPA 與DHA 空間結構對比（省去碳鏈氫原子）[57]Fig.3 Comparison of EPA and DHA structures in glyceride （Hydrogen atoms on the carbon chain are not shown）[57]

1.2 EPA 專一性酶

EPA 專一性酶是指那些對EPA 具有選擇性，對其它脂肪酸選擇性不強的酶，主要是一些米赫毛霉 （Mucor meihei） 脂肪酶和假單胞菌（Pseudomonas）脂肪酶，這種脂肪酶可以用來富集EPA。脂肪酶的作用位點在分子的酯鍵上，因此脂肪酶需要與酯鍵結合才能起到催化作用，而DHA 的碳鏈甲基端離酯鍵的距離更近，從而更容易阻擋酶與酯鍵的結合，所以大多數脂肪酶更容易催化EPA。因此，具有EPA 專一性的脂肪酶通常比較少見。Yamane 等[40]用游離的n-3PUFA 和n-3PUFA甲酯與富含n-3PUFA 的魚肝油在固定化酶米赫毛霉脂肪酶的催化下進行轉酯化反應，研究發(fā)現(xiàn)當單獨使用EPA 時，富集在魚肝油中的EPA 含量可達57%，而如果使用EPA 和DHA 的混合物，魚肝油中的EPA 含量在5 h 后開始下降，而DHA的含量上升。后續(xù)研究表明出現(xiàn)這樣現(xiàn)象的原因是由于魚油中EPA 被DHA 所取代而達到了一個新的平衡。利用酶的這種特性，可以從混合酯中分離制備EPA。Fajardo 等[41]利用商業(yè)化的米赫毛霉脂肪酶催化棕櫚油與n-3PUFA 反應，并且使用正己烷作為反應體系，反應24 h 后，產物中含有20.8%的EPA 和15.6%的DHA，相對于原料而言，EPA 含量明顯增加而DHA 含量的增加不明顯。Haraldsson 等[42]對比了17 種脂肪酶催化乙醇與含有n-3PUFA 的甘油酯進行轉酯化反應，發(fā)現(xiàn)假單胞菌脂肪酶對飽和及單不飽和脂肪酸的催化活性高，可以同時富集DHA 和EPA。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，在假單胞菌脂肪酶所催化的酯交換反應中，DHA 比EPA 的反應要更快一些，這是一種比較少見的情況。隨后[35]又做了12 種脂肪酶富集沙丁魚油中PUFA 的研究，研究發(fā)現(xiàn)洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia） 脂肪酶，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens） 脂肪酶這兩種脂肪酶更容易水解DHA 形成的酯，其它來源的脂肪酶更容易水解EPA 形成的酯。總之，EPA 專一性酶的研究比較少見，并且相關的作用機理還不明確，值得進一步開發(fā)與研究。

1.3 DHA、EPA 專一性酶

DHA、EPA 專一性酶是指那些對飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸沒有選擇性，對EPA 和DHA有選擇性的酶，這類酶可以同時富集DHA 和EPA，然而對DHA 和EPA 的分離效果較差，主要有白地霉（Geotrichum candidum）脂肪酶，南極假絲酵母（Candida antarctica）脂肪酶，綿毛嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosa）脂肪酶等[43]。Shimada等[44]研究結果表明，在白地霉脂肪酶的催化作用下，金槍魚油中的n-3PUFA （主要是DHA 和EPA）會富集在甘油酯中，而且水解結束后產物主要是甘油三酯。金槍魚油在溫度為30 ℃，酶解時間為16 h 的條件下，水解度為33.5%，水解產物中含有48.7%的EPA 和DHA 甘油酯；經過第2 步水解，DHA、EPA 甘油酯的含量提高到57.5%，得率為54.5%，回收率為81.5%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，白地霉脂肪酶富集甘油三酯型DHA、EPA 的機制主要是通過催化偏甘油酯（甘油單酯、甘油二酯）與n-3 發(fā)生縮合反應以及偏甘油酯之間的?；D移反應來實現(xiàn)。南極假絲酵母脂肪酶是一種來源于南極假絲酵母的脂肪酶，已經被廣泛地用于工業(yè)生產，并且有成型的工業(yè)產品。Novozym 435 就是將來自南極假絲酵母脂肪酶固定于大孔吸附樹脂上的脂肪酶，主要用于酯化法合成油酯的研究。Cerdan 等[45]采用Novozym 435 在正己烷體系催化DHA、EPA 與甘油的酯化反應，在優(yōu)化后的反應條件下，產物中甘油酯的含量達到84.4%，且甘油三酯中主要成分是DHA 和EPA。陳小娥等[46]以游離DHA 和EPA 與甘油發(fā)生酯化反應制備PUFA 甘油三酯，考察了合成的影響因素。結果表明，正己烷6 mL，甘油/EPA（DHA）摩爾比為1 ∶3，Novozym 435 添加量為100 mg，反應溫度為40 ℃，振蕩頻率150 r/min，反應24 h 后加1 g 分子篩，反應時間48 h，EPA 甘油三酯和DHA 甘油三酯的得率分別可達到88.64%。全文琴[47]利用粗魚油進行化學水解，制備出高純度的游離脂肪酸，通過C18 柱將DHA 和EPA 分離，最后將純化的DHA 和EPA 與甘油混合，在Novozym 435 催化下得到純度較高的甘油酯型DHA 和EPA。Lei 等[48]對比了米氏根霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶，綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶 和Novozyme 435 脂肪酶在富集n-PUFA時的特性。對于水分來講，Novozyme 435 在較干燥的條件下（2%水分含量）表現(xiàn)較好，然而綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶和米氏根霉脂肪酶需要較高的水分含量（3%，4%）；真空適合于Novozyme 435，氮吹適用于另外兩種酶的后續(xù)研究；就溫度而言，Novozyme 435 和米氏根霉脂肪酶的富集效果隨著溫度的升高，增加不明顯，并且在40 ℃和50 ℃附近的富集效果較差，綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶可以耐受較高的溫度，并且在40～60 ℃范圍內富集效果最好。綜合考慮綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶具有較好的富集效果。此外，綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶催化的酯交換反應（40 ℃，2.5 h，氮吹） 可以將n-3PUFA 轉化成TAG，具有較高的融點。得到的產物中主要為DHA 和EPA。Solaesa 等[49]通過Novozyme 435 對沙丁魚進行酶促甘油解反應來制備甘油酯混合物，隨后進行逐步蒸餾來進一步富集甘油酯混合物中的DHA 和EPA。短程蒸餾在UIC KDL 5 系統(tǒng)（真空為10-3mbar，供料流量為1 mL/min）中進行，第1 次蒸餾在蒸餾溫度為110℃的條件下，目的是徹底除去甘油和大部分的游離脂肪酸；第2 步蒸餾溫度為155 ℃；餾出物的純度為91%，回收率為94%。得到的產物的主要成分是DHA 和EPA 的甘油酯。

2 固定化酶技術的應用及擴大試驗

酶工程技術特別是固定化酶技術的發(fā)展大大降低酶法生產高純度DHA、EPA 的成本，發(fā)酵罐培養(yǎng)技術的進一步發(fā)展為酶法生產DHA、EPA 的工業(yè)化提供了技術支持。固定化酶與一般水溶性酶相比，以固相狀態(tài)作用于底物，這樣不僅保留了酶原有的優(yōu)點，而且反應后酶易與反應液分離，有利于產物的進一步分離純化。脂肪酶通過與油層界面的接觸不能夠充分發(fā)揮它的作用，因為油不能滲透到催化劑的多孔構造中，有機助溶劑雖然可以促進酶與油的接觸，但同時有機助溶劑也可以促進酶從疏水性載體上的解吸附。解決問題的方法一般是通過在脂肪酶表面添加多孔滲水的疏水載體，因為這樣可以促進界面活化，提高酶的催化效率[50-51]。脂肪酶經固定化處理后，穩(wěn)定性提高，催化效率提高，機械強度增加。Fernández-Lorente等[52]通交聯(lián)的方法使米氏根霉脂肪酶與多官能團的高聚物（醛葡聚糖）結合，通過優(yōu)化交聯(lián)條件，吸附酶的解析大大降低。在有機助溶劑和洗滌劑沖洗后，超過95%的交聯(lián)固定化酶米氏根霉脂肪酶仍然吸附在載體上。這種新的、固定化的米氏根霉脂肪酶有效地促進了DHA、EPA 的富集，并且在反應過程中很穩(wěn)定。固定化酶的半衰期大大延長。胡隼等[53]采用吸附法將酵母脂肪酶固定在特殊的酶布上，對比了固定化酶與傳統(tǒng)商業(yè)酶在催化反應上的不同。發(fā)現(xiàn)固定化使酶與底物充分接觸，增加了酶促反應的效率，降低了反應過程中酶的用量，并且提高了產物中DHA、EPA 的含量。印度學者Aarthy[54]利用PDA 培養(yǎng)基在4 ℃培養(yǎng)酵母菌株，利用菌株產生隱球酵母脂肪酶對沙丁魚油中的DHA、EPA 進行富集。試驗先是在實驗室小規(guī)模操作，之后利用固定化酶技術結合發(fā)酵罐培養(yǎng)技術進行擴大試驗。擴大試驗是在一個3.7 L 的發(fā)酵罐培養(yǎng)，攪拌器轉速為300 r/min，氣流速度為1 m3/min，溫度為25 ℃，培養(yǎng)時間72 h，此條件下，最大的酶活力是 （60±2）U/mL，生產效率為0.8 U/mL/h，酶活生產力是搖瓶培養(yǎng)條件下的1.6 倍。濃縮的酶可以有效水解沙丁魚油，產物中DHA、EPA的含量是最初原料的1.8 和2.6 倍。Kahveci 等[55]利用褶皺假絲酵母脂肪酶對沙丁魚加工廢棄物中的DHA、EPA 進行富集。通過多步水解使n-3PUFA 在廢棄物油中的含量增加量超過了300%，并且反復水解后EPA 和DHA 的回收率只出現(xiàn)輕微下降。反應被放大到中型攪拌釜反應器中，在最優(yōu)條件下，產物中的DHA 和EPA 的含量超過了50%，是原料的4 倍，這種方法適合于大規(guī)模生產，因為上一步反應產物純化后可以重新循環(huán)到反應器中，不經任何附加處理。Wang 等[56]以高酸度的魚油為原料，利用商業(yè)化的固定化酶Novozym 435 制備高純度的n-3PUFA 甘油酯。這個工藝包括粗魚油的脫酸，堿法合成PUFA 乙酯，濃縮PUFA 乙酯，酶法催化合成PUFA 甘油酯，合成的甘油酯含有5.5%的EPA 和74.6%的DHA，是初始魚油的1.21 倍和2.71 倍。該試驗成功地被放大了100 倍，證明可行，為酶法生產DHA、EPA的產業(yè)化提供了重要參考。

3 展望

酶法生產DHA、EPA 具有能耗低，反應條件溫和等特點，產物具有良好的感官特征。通常情況下，利用一種類型的脂肪酶很難達到預定的分離和純化效果。因此，在制備DHA、EPA 的過程中，利用不同類型酶的特性不同，實現(xiàn)協(xié)同效應，對于實際生產至關重要[57]。Yuji 等[58]采用兩步酶解法將多元不飽和脂肪酸富集在游離脂肪酸中，先篩選出一種對n-3PUFA 水解效果與其它脂肪酸水解效果相差不大的酶，對富含n-3PUFA 的油脂進行水解，再進行選擇性酯化。在第1 步水解過程中采用酶法水解，從而避免了熱堿法帶來的PUFA 異構化及廢水排放等問題，利用假單胞菌脂肪酶對油脂中的DHA 和EPA 進行水解；第2 步酯化反應過程中，以月桂醇為反應溶劑，以米氏根霉脂肪酶為催化劑，使除DHA 以外的脂肪酸優(yōu)先被酯化，得到游離脂肪酸中的DHA 含量提升到71.6%，進一步用正己烷對游離脂肪酸進行萃取，再次進行選擇酯化，制得濃度為91%的DHA 樣品。Breivik 等[59]將脂肪酶法與化學法相結合分離DHA 和EPA，首先將魚油經過假單胞菌脂肪酶催化乙醇解，使DHA 和EPA 富集在甘油酯上，經過一次短程蒸餾，n-3PUFA 的含量在40%～50%，收率達88%。然后利用米赫毛霉脂肪酶的選擇性乙醇解，使EPA 以EPA 乙酯的形式富集，而DHA 仍在甘油酯上，再一次短程蒸餾將甘油酯與乙酯分離，富含DHA 的甘油酯在南極假絲酵母脂肪酶的催化下進一步乙醇解，得到富集的DHA 乙酯，工藝見圖4。脂肪酶法富集DHA、EPA 具有選擇性強，反應條件溫和，產品質量穩(wěn)定等優(yōu)點，因此在未來工業(yè)應用中有比較明顯的優(yōu)勢。由于目前的研究工作尚不完善，對部分酶的作用機理還不明確，需要對系統(tǒng)做更深入的研究。此外，酶法富集DHA、EPA 應用于工業(yè)的瓶頸主要在于脂肪酶的成本較高，所以通過酶工程技術來提高酶的回用次數，開發(fā)新的酶資源，降低單位產品的原料成本值得深入研究。

圖4 脂肪酶法分離魚油中的DHA 與EPAFig.4 Separation of DHA and EPA in fish oil by lipase

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