何萬領(lǐng) 李曉麗 楊肖娥

（1 河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院 動物生物飼料與精準(zhǔn)營養(yǎng)實驗室 河南洛陽471023 2 環(huán)境修復(fù)與資源再生教育部重點實驗室 浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院 杭州310029）

缺鐵是個世界性的營養(yǎng)失調(diào)問題，補(bǔ)充一定劑量的鐵劑被認(rèn)為是有效預(yù)防鐵缺乏的重要措施[1]。然而，飲食中的某些成分可能在一定程度上抑制鐵的吸收[2-3]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中的多酚類物質(zhì)能與鐵離子結(jié)合，并抑制鐵的吸收[4-6]。然而，關(guān)于飲茶與鐵吸收之間關(guān)系的研究結(jié)果，目前說法不一。部分研究通過直接添加多酚類或提取茶葉成分再添加的方式研究其對鐵吸收的影響，均發(fā)現(xiàn)鐵吸收受到顯著抑制[7-8]。Kaltwasser[9]對遺傳性血色病人的臨床試驗表明，進(jìn)餐的同時飲茶可降低鐵吸收，并增加體內(nèi)貯存鐵的消耗。而另一用SD 大鼠模型的研究表明，飲茶對鐵吸收的影響作用并不明顯[10]。筆者認(rèn)為以上研究結(jié)果的差異可能與實驗?zāi)Ｐ?、鐵形態(tài)、飲茶間隔以及飲茶時間等有關(guān)。目前，在微量元素生物有效性研究方面，最常用于代替人體的實驗?zāi)Ｐ蜑镾D 大鼠模型[11-12]和Caco-2 細(xì)胞模型[13-14]。本試驗利用SD 大鼠模型聯(lián)合Caco-2 細(xì)胞模型研究飲茶對硫酸亞鐵、EDTA-FeNa 和檸檬酸亞鐵3 種形態(tài)鐵生物有效性的影響，以揭示飲茶與鐵吸收的關(guān)系，從而為人們合理飲食，進(jìn)而提高鐵吸收提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD 大鼠，河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗材料中心；Caco-2 細(xì)胞株，中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；龍井茶葉，杭州英仕利生物科技有限公司；FeSO4·7H2O（分析純）、EDTA-FeNa（分析純）和檸檬酸亞鐵（分析純），美國Sigma 公司。試驗中所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動血細(xì)胞分析儀（XF9080A），南京浩海儀器儀表有限公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（7500a），美 國Agilent 公 司；二 氧 化 碳 培 養(yǎng) 箱（B15），德國 Kendro Laboratory products GmbH公司；超凈工作臺（SJ-CJ-2FD），蘇潔醫(yī)療器械有限公司；倒置顯微鏡（TE2000U），日本Nikon 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 SD 大鼠模型構(gòu)建 試驗選用84 只生長健康、體質(zhì)量（60±1）g 的雌性SD 大鼠隨機(jī)分成A，B，C，D，E，F(xiàn)，G 共7 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)4 只大鼠。其中A 組為對照組，飼喂不加鐵的基礎(chǔ)日糧，B，C，D 組分別在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加40 mg/kg（以鐵計）的硫酸亞鐵，EDTA-FeNa 和檸檬酸亞鐵，以上各組飲水為去離子水；E，F(xiàn)，G 組日糧組成分別與B，C，D 組相同，飲用水改為用去離子水泡制的龍井茶。

龍井茶配制：稱取5 g 龍井茶葉，放入已冷卻至80 ℃的去離子水中，浸泡10 min，過濾，取茶湯，冷卻后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ㄒ竺看闻渲频牟铚? d 內(nèi)用完，否則棄掉，按上述方法重新配制）。

各試驗組大鼠均采用塑料筐飼養(yǎng)，上層為不銹鋼網(wǎng)，飲水瓶為塑料質(zhì)地，為防止鐵的污染，凡SD 大鼠飼喂用具統(tǒng)一用稀鹽酸過夜浸泡，以去除鐵的污染。試驗開始前，各組均飼喂不加鐵的基礎(chǔ)日糧，飲用去離子水1 周，隨后，各組按照上述設(shè)計飼喂和飲水。試驗期間管理條件相同，每周稱重1 次，試驗期為30 d。

1.3.2 體外消化/Caco-2 細(xì)胞模型構(gòu)建

1） 細(xì)胞培養(yǎng)與模型建立 在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國Corning）中對Caco-2 細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，試驗所用培養(yǎng)基為DMEM 高糖混合培養(yǎng)基，其主要成分（含量）：胎牛血清（10%）、非必需氨基酸（1%）、L-谷氨酰胺（2 mmol/L）、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）和MEM（Minimum essential medium）基礎(chǔ)培養(yǎng)液。細(xì)胞在37 ℃，5%二氧化碳和90%相對濕度的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d 換新鮮培養(yǎng)液1 次，經(jīng)過20～30 次的傳代后用于吸收試驗。

將在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長至80%～90%融合的細(xì)胞接種于6 孔Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)板的插入槽中（膜孔徑0.4 μm，生長面積4.7 cm2），接種密度為105個/cm2。從而構(gòu)建成Caco-2 細(xì)胞吸收模型。轉(zhuǎn)運槽頂膜側(cè)加入1.5 mL MEM 混合培養(yǎng)基，基底側(cè)加入2.5 mL 混合培養(yǎng)基，第1 周每48 h 換液，一周之后每24 h 換液，細(xì)胞培養(yǎng)到21 d 后備用。用于吸收試驗前先進(jìn)行細(xì)胞單層形態(tài)學(xué)和生化分析，以確定是否可用于試驗。

2） 細(xì)胞鐵吸收試驗設(shè)計 胃液、胰液配制以及硫酸亞鐵、EDTA-FeNa 和檸檬酸亞鐵的模擬胃、腸道消化步驟參考Glahn 等[13]的方法，最終獲得鐵消化液。

茶孵育對不同形態(tài)鐵吸收影響的試驗設(shè)計：用移液槍準(zhǔn)確吸取新鮮的上述鐵消化液1.0 mL，與一定體積MEM 培養(yǎng)基混合，配制成鐵濃度為70 μmol/L（研究者早期的一些研究發(fā)現(xiàn)，高鐵濃度易導(dǎo)致細(xì)胞毒性，為此在本實驗中選用SD 大鼠日糧添加的1/10 量，并按照等比例原則設(shè)計茶湯的用量）的細(xì)胞培養(yǎng)液，準(zhǔn)確吸取該系列培養(yǎng)液1.5 mL 加入培養(yǎng)板頂部，在培養(yǎng)板基底部加入2.5 mL 無血清的MEM，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)22 h。

茶孵育時間對鐵吸收影響的試驗設(shè)計：選用70 μmol/L 的硫酸亞鐵作為孵育液，分別在硫酸亞鐵孵育后的0，5，10，20，30，45，60，90 min 添加龍井茶溶液，繼續(xù)孵育22 h。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測定

1.4.1 SD 大鼠樣品采集和指標(biāo)測定

1） 血液生理指標(biāo)測定 動物試驗結(jié)束后，心臟采血，迅速用全自動血細(xì)胞分析儀 （型號：XF9080A）測定紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）和血紅蛋白濃度（Hb）。

2） 血清總鐵含量的測定 在酸性溶液和還原劑的作用下，使運鐵蛋白中的鐵與蛋白分離，使血清中的高鐵還原成亞鐵。后者與雙吡啶結(jié)合成粉紅色的絡(luò)合物。在一定范圍內(nèi)，鐵離子的多少與色澤呈正比。計算公式：血清鐵含量＝（R－B／S－B）×標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度 （2 mg/L）。式中，R——測定管；B——空白管；S——標(biāo)準(zhǔn)管。

3） 血清總鐵結(jié)合力的測定 在血清中加入已知量的鐵標(biāo)準(zhǔn)液，使血清中全部的轉(zhuǎn)運鐵（Tf）與鐵結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)，再用吸附劑（輕質(zhì)碳酸鎂）除去多余的鐵。再按測定血清鐵的方法測定鐵的含量，其結(jié)果為總鐵結(jié)合力，如再減去先測的血清鐵，則為未飽和鐵結(jié)合力（UIBC）。計算公式：總鐵結(jié)合力＝（R－B／S－B）×標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（1 mg/L）×樣本測試前的稀釋倍數(shù) （2）。式中，R——測定管；B——空白管；S——標(biāo)準(zhǔn)管。

4） 肝臟、 腎臟鐵含量的測定 將大鼠肝臟、腎臟于烘箱內(nèi)烘干至恒重，磨碎，準(zhǔn)確稱取0.01 g，置于50 mL 特福龍管中，用5 mL 移液槍準(zhǔn)確吸取鹽酸4.5 mL，混勻，靜止過夜后，加入0.5 mL 雙氧水，用微波消解儀消化，消化具體程序：60 ℃30 min，115～120 ℃2 h，125 ℃30 min，消化液置于50 mL 塑料瓶中，用去離子水定重25 g。用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定其鐵的含量。

1.4.2 細(xì)胞樣品的收集與測定 細(xì)胞試驗結(jié)束后，吸出培養(yǎng)液，用D-Hank’s 液沖洗2 次，每次2 mL。將培養(yǎng)板放入超聲波振蕩器中破碎15 min，此過程在4 ℃冷室內(nèi)進(jìn)行。用2 mL 去離子水充分沖洗細(xì)胞入5 mL 塑料離心管中。取部分通過考馬斯亮藍(lán)法測定細(xì)胞蛋白質(zhì)。取部分細(xì)胞混合液，用鐵蛋白試劑盒測定細(xì)胞鐵蛋白量。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel 軟件進(jìn)行初步分析后，用SPASS13.0 版統(tǒng)計軟件中的ANOVA 模塊進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD 法多重比較，所有結(jié)果均用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飲茶對SD 大鼠鐵生物有效性的影響

飲茶對補(bǔ)鐵SD 大鼠血液紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白量的影響見表1。與對照組相比，補(bǔ)鐵各組血紅蛋白、 紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞壓積均有不同程度升高，其中補(bǔ)鐵各組大鼠血紅蛋白量顯著高于對照組（P＜0.05）。飲茶后，大鼠紅細(xì)胞數(shù)均不同程度低于對照組，其中檸檬酸亞鐵組在飲茶后其紅細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05）。與各單純補(bǔ)鐵組相比，飲茶降低了補(bǔ)鐵的效果，且對EDTA-FeNa（P＜0.05）和檸檬酸亞鐵（P＜0.05）組的抑制效果最顯著。飲茶雖降低了補(bǔ)鐵大鼠紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白量，但均未達(dá)顯著水平（P＞0.05）。

飲茶對SD 大鼠血清總鐵結(jié)合力和血清總鐵含量的影響見表2。結(jié)果表明，3 種鐵化合物均在不同程度提高了大鼠的血清總鐵結(jié)合力和血清總鐵，尤其是EDTA-FeNa 組效果最好，其血清總鐵結(jié)合力和血清總鐵量分別較硫酸亞鐵和檸檬酸亞鐵組高16.04%，13.35%和5.35%，16.84%。飲茶各組血清總鐵結(jié)合力和血清總鐵含量均高于對照組，而與單純補(bǔ)鐵組相比，其影響效果不顯著。

表1 飲茶對補(bǔ)鐵雌性SD 大鼠血液RBC、HCT、Hb 的影響Table1 Effects of tea on RBC，HCT and Hb in blood of female SD rats fed with iron

表2 飲茶對補(bǔ)鐵雌性SD 大鼠血清總鐵結(jié)合力和血清總鐵的影響Table2 Effects of tea on serum total iron binding capacity and serum total iron of female SD rats fed with iron

從表3結(jié)果可知，補(bǔ)鐵各組大鼠肝臟和腎臟鐵含量均高于對照組。硫酸亞鐵、EDTA-FeNa 和檸檬酸亞鐵組肝臟鐵含量分別提高了71.12%（P＜0.05）、87.1%（P＜0.05）和48.87%（P＞0.05），腎臟鐵含量分別提高4.75%（P＞0.05）、92.94%（P＜0.05）和10.2%（P＞0.05）。飲茶在不同程度上降低了補(bǔ)鐵大鼠肝臟和腎臟中鐵含量，硫酸亞鐵、EDTA-FeNa和檸檬酸亞鐵組分別降低了15.07%，20.25%，26.88%和18.49%，30.19%，24.77%，雖無顯著性差異。

表3 飲茶對補(bǔ)鐵雌性SD 大鼠肝臟和腎臟中鐵含量的影響（mg/kg 鮮組織樣）Table3 Effects of tea on iron content in liver and kidney of female SD rats fed with iron （mg/kg Fresh foundation）

2.2 茶孵育對Caco-2 細(xì)胞鐵吸收的影響

Caco-2 細(xì)胞吸收試驗表明，用龍井茶配制的鐵孵育液其鐵吸收均在不同程度上受到影響（見圖1）。與對照組相比，硫酸亞鐵、EDTA-FeNa 和檸檬酸亞鐵組Caco-2 細(xì)胞鐵蛋白合成量分別增加了78.57%（P＜0.05）、202.79%（P＜0.05）和146.08%（P＜0.05），而用茶孵育后，細(xì)胞鐵蛋白量較相應(yīng)鐵組 減少了39.52%（P＜0.05）、29.73%（P＞0.05）和48.82%（P＜0.05）。

圖2顯示補(bǔ)鐵后一定時間進(jìn)行茶孵育細(xì)胞對鐵生物有效性的影響。結(jié)果表明，補(bǔ)鐵同時立即給予茶孵育，其細(xì)胞鐵蛋白量為（20.11±0.95）ng/mg蛋白質(zhì)，5，10，20，30，45，60，90 min 后給予茶水孵育，其鐵蛋白量分別增加了0.47，3.6，6.03，12.1，12.78，13.94，13.68 ng/mg 蛋白質(zhì)。由此可見，補(bǔ)鐵同時飲茶會嚴(yán)重影響鐵的生物有效性，尤其是補(bǔ)鐵后30 min 內(nèi)飲茶對鐵生物有效性有明顯降低作用，而補(bǔ)鐵45 min 后再飲茶，對鐵生物有效性影響不顯著。

圖1 茶孵育對Caco-2 細(xì)胞鐵吸收的影響Fig.1 Effects of tea on iron unptake by Caco-2 cells

圖2 補(bǔ)鐵后不同間隔時間飲茶對鐵生物有效性的影響Fig.2 Effects of drinking tea at different intervals after iron supplementation on iron bioavailability

3 結(jié)論與討論

3.1 兩種模型在鐵生物有效性評價中的應(yīng)用效果

人體干預(yù)實驗是直接反映試驗因子效果的最佳方法，然而，由于在倫理道德和具體實施上存在很大困難[15]，實際操作中多采用一些模型進(jìn)行相關(guān)研究。大鼠模型是較早用于代替人體實驗的模型[16]。Forbes 等[11]利用“大鼠血紅素再生法”（Rat hemoglobin repletion bioassay）研究鐵的生物有效性，并發(fā)現(xiàn)與人體實驗達(dá)到顯著相關(guān)。隨后很長一段時間，研究者們利用該模型研究了鐵對人體的生物有效性。然而，Lopez 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腸道內(nèi)的植酸酶活性顯著高于人體。這表明，采用大鼠模型研究鐵吸收的影響試驗，其可行性值得探討[17]。而Caco-2 細(xì)胞來源于人的結(jié)腸癌細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后可形成類似于人腸道細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生化學(xué)特征[18]。Glahn 等[13]利用Caco-2 細(xì)胞模型研究鐵的生物有效性，發(fā)現(xiàn)其與人體實驗顯著相關(guān)。目前，利用Caco-2 細(xì)胞模型研究人體對鐵的生物有效性得到了廣泛認(rèn)可[19，20]。本實驗利用SD 大鼠模型和Caco-2 細(xì)胞模型研究幾種形態(tài)鐵的生物有效性及其影響因素，發(fā)現(xiàn)血清Hb、血清鐵、肝臟和腎臟鐵是較為敏感的鐵生物有效性指標(biāo)，其反映出的結(jié)果與Caco-2 細(xì)胞結(jié)果具有很強(qiáng)的相似性。這一結(jié)果表明，兩種模型均可代替人體實驗用于鐵生物有效性研究，而大鼠模型尚需要進(jìn)一步選擇敏感的反應(yīng)指標(biāo)。

3.2 不同形態(tài)鐵生物有效性分析

鐵化合物種類不同，其生物有效性也存在差異。本實驗利用大鼠模型和細(xì)胞模型研究結(jié)果均表明，不同形態(tài)鐵生物有效性存在很大差異，其中EDTA-FeNa 的生物有效性最高，檸檬酸亞鐵次之，這一結(jié)果和早期研究結(jié)果相似[21-22]。而關(guān)于不同形態(tài)鐵化合物對鐵生物有效性的影響機(jī)制目前并不十分清楚，大部分研究認(rèn)為可能是不同形態(tài)鐵化合物釋放鐵的效率以及對鐵的保護(hù)機(jī)制不同所致[8，23]。一般水溶性好的鐵化合物，其釋放鐵離子的效率較高，生物有效性也高。另有研究指出，水溶性強(qiáng)的鐵化合物由于釋放鐵離子的速度過快，游離態(tài)的鐵離子在沒有被吸收之前，很容易被食物成分結(jié)合而降低其有效性[24]。也有研究認(rèn)為，一些有機(jī)態(tài)或螯合態(tài)鐵在吸收過程中緩慢解離，分離出的有機(jī)物可能具有促進(jìn)鐵吸收的作用[22]，或者不被解離而以完整形態(tài)被吸收。此外，本研究認(rèn)為，EDTA-FeNa 和檸檬酸亞鐵的生物有效性高于硫酸亞鐵，可能由于硫酸亞鐵更容易氧化成三價鐵，EDTA 和檸檬酸對二價鐵均有一定保護(hù)能力。而人體（動物）和細(xì)胞主要吸收二價鐵，對三價鐵的利用效率低[25]。

3.3 飲茶對鐵生物有效性的影響

科學(xué)的飲茶被認(rèn)為具有促進(jìn)人體健康的作用，是由于茶葉中含有對生物體有益的生物活性成分，如茶多酚等[26]。然而，研究表明，茶多酚可與鐵離子結(jié)合成穩(wěn)定的絡(luò)合物[27]，從而降低鐵吸收[5，6，24]。Glahn 等[8]研究多酚類對鐵吸收的影響表明，多酚類對鐵吸收有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)多酚類/鐵摩爾比為1∶1 時具有最大的抑制效果。Yun等[28]研究也表明，當(dāng)試驗中依次添加0，5，10，25，50，100，200 mg 單寧酸后，Caco-2 細(xì)胞鐵蛋白合成量依次降低，單寧酸添加量為10 mg 時，已對鐵吸收達(dá)到顯著抑制。Samman 等[9]將綠茶提取物添加到食物中，發(fā)現(xiàn)食物中非血紅素鐵吸收被抑制。然而有些動物實驗結(jié)果表明，飲茶對鐵吸收影響不大。Kim 等[29]研究指出，適當(dāng)飲茶對鐵吸收并無不利影響。陳飛飛等[11]利用SD 大鼠研究也表明，補(bǔ)鐵一定時間后再飲茶對鐵吸收并無顯著影響。本試驗研究表明，當(dāng)補(bǔ)鐵與飲茶同時進(jìn)行，硫酸亞鐵、EDTA-FeNa 和檸檬酸亞鐵的生物有效性受到不同程度的影響，其中，硫酸亞鐵受影響最大，檸檬酸亞鐵次之，EDTA-FeNa 受影響最小。采用SD大鼠模型，以Hb 血清鐵、肝臟鐵和腎臟鐵作為衡量指標(biāo)時，飲茶對鐵吸收的抑制率為12%～31%；采用Caco-2 細(xì)胞模型，以鐵蛋白形成量作為指標(biāo)時，飲茶對鐵吸收的抑制率為29%～49%。這一結(jié)果表明，飲茶對鐵生物有效性有抑制作用；若在補(bǔ)鐵45 min 后飲茶，鐵生物有效性基本不受影響。綜合本研究結(jié)果，SD 大鼠模型和Caco-2 細(xì)胞模型在評價鐵生物有效性方面具有很好的一致性。飲茶能夠抑制硫酸亞鐵、EDTA-FeNa 和檸檬酸亞鐵的生物有效性，抑制效果與鐵形態(tài)相關(guān)。建議補(bǔ)鐵人群，在補(bǔ)鐵過程中盡量不飲茶，或補(bǔ)鐵45 min 后，再飲茶。