李 豪 周萬(wàn)怡 吳嘉南 陳啟和

（浙江大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系 杭州310058）

白樺脂酸（Betulinic acid），又名樺木酸，是一種天然存在的五環(huán)三萜類化合物，具有抗炎[1]、抗癌[2]等多種生物活性[3]。在自然界中廣泛存在，其大量存在于樺木屬植物中，在白樺樹(shù)皮中含量最為豐富[4]。目前，白樺脂酸的來(lái)源主要有3 種：一是從天然植物中提取分離所得；二是以白樺脂醇為前體，通過(guò)有機(jī)合成所得；三是以白樺脂醇為前體，通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化所得。

1995年首次發(fā)現(xiàn)白樺脂酸可以選擇性地殺死人類黑色素瘤細(xì)胞[5]，而不殺傷健康細(xì)胞，并進(jìn)一步證實(shí)其能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。隨后大量試驗(yàn)表明白樺脂酸具有廣泛的抗腫瘤活性，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，包括白血病細(xì)胞[7]、腦瘤[8]、神經(jīng)外胚層瘤[9]、前列腺癌[10]、卵巢癌[11]、乳腺癌[12]、肺癌、結(jié)腸癌[13]以及宮頸癌[14-15]等細(xì)胞。此外，它還能阻止腫瘤的形成及發(fā)展。

白樺脂酸作為一種有著良好前景的抗腫瘤藥物，目前對(duì)人的肝癌細(xì)胞HepG2 的作用及其機(jī)制還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。本試驗(yàn)旨在研究白樺脂酸對(duì)HepG2 增值、 凋亡的影響及其可能的機(jī)制，為其進(jìn)行臨床抗腫瘤、 抗癌治療提供一些試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

白樺脂酸，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。使用時(shí)需要用DMSO 溶解，用無(wú)菌的0.22 μm 的有機(jī)系濾膜過(guò)濾除菌。使用時(shí)，先配成5 mg/mL 的母液，然后根據(jù)需要用完全培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度。

1.2 細(xì)胞

人肝癌HepG2 細(xì)胞株，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。用含有10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素、鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d 傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 試劑材料

DMEM 培養(yǎng)基，Corning；胎牛血清，杭州四季青生物科技公司；胰酶、青霉素、鏈霉素雙抗，Hy-Clone；PBS 緩沖液（配制：NaCl 0.85 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.85 g，KH2PO40.27 g，蒸餾水1 L）；DMSO、MTT，北京索萊寶生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V-FITC/PI，聯(lián)科生物科技公司AP101-100-kit；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒，聯(lián)科生物科技公司CCS012；羅丹明123 染色試劑盒，南京凱基生物科技有限公司KGA217。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO；倒置顯微鏡，德國(guó)LEICA；FC500MCL 流式細(xì)胞儀，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特；酶標(biāo)儀，Thermo 公司。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 細(xì)胞存活率檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞消化傳代，細(xì)胞以每孔2.5×105/mL 的密度接種100 μL 于無(wú)菌的96 孔板中，在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過(guò)夜約24 h 待細(xì)胞貼壁后，將原來(lái)的培養(yǎng)基吸出，加入含白樺脂酸（終質(zhì)量濃度分別為2.5，5，10，20，30，40，60，80 μg/mL）的完全培養(yǎng)液，每孔100 μL，各試驗(yàn)組每組均設(shè)6個(gè)平行孔，鋪3 個(gè)板，分別于24，48，72 h 后終止培養(yǎng)，24 h 換一次藥。試驗(yàn)中同時(shí)設(shè)定不加藥物的正常對(duì)照組，以及既不加藥物也不加細(xì)胞的空白對(duì)照組。

加藥培養(yǎng)24，48，72 h 后，小心棄培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h 后，每孔加入150 μL DMSO，充分振蕩10 min溶解紫色結(jié)晶，置酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)570 nm 下的吸光度，間接反應(yīng)細(xì)胞存活率。按照下列細(xì)胞存活率計(jì)算公式：細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

1.5.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔2.5×105/mL 的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，加入0，20，30，40 μg/mL 的白樺脂酸培養(yǎng)液2 mL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。48 h 后用胰酶消化細(xì)胞，在4 ℃下1 500 r/min 離心5 min收集細(xì)胞，每個(gè)樣用預(yù)冷的PBS 洗2 次。每個(gè)樣收集約106個(gè)細(xì)胞，在每個(gè)管里加500 μL 1×Binding Buffer。在避光的環(huán)境中，加入5 μL Annexin VFITC，混勻，再加入5 μL PI，混勻。

此前應(yīng)從未經(jīng)藥物干預(yù)的細(xì)胞中分出3 管細(xì)胞，用于設(shè)門。具體方法為：空白，只加結(jié)合緩沖液；V 單染，加結(jié)合緩沖液和5 μL Annexin VFITC，不加PI；PI 單染，加結(jié)合緩沖液，5 μL PI，不加Annexin V-FITC。在室溫中避光反應(yīng)5 min，之后轉(zhuǎn)入到流式管中。放入冰盒中，等待上流式儀檢測(cè)。

結(jié)果判讀：散點(diǎn)圖左下象限LL：正常細(xì)胞群，Annexin-V （-），PI （-）；右下象限LR：早期凋亡細(xì)胞群，Annexin-V （+），PI （-）；右上象限UR：晚期凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞群，Annexin-V （+），PI（+）；左上象限UL：機(jī)械損傷或壞死細(xì)胞群，Annexin-V （-），PI（+）。計(jì)算總凋亡率=LR%+UR%。

1.5.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔2.5×105/mL 的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，加入0，20，40，80 μg/mL 的白樺脂酸培養(yǎng)液2 mL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。48 h 后用胰酶消化細(xì)胞，在4 ℃下1 500 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞，每個(gè)樣用預(yù)冷的PBS 洗2 次。每個(gè)樣收集約106個(gè)細(xì)胞。棄去PBS 后，加入預(yù)冷的75%乙醇，-20 ℃固定過(guò)夜。離心收集固定后的細(xì)胞，用PBS 洗1 次，離心去上清，加入1 mL DNA Staining solution，渦旋振蕩5～10 s，使其混勻，濃度約為106/mL，室溫避光孵育30 min 后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5.4 線粒體膜電位檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔2.5×105/mL 的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，加入不同質(zhì)量濃度的白樺脂酸培養(yǎng)基處理24 h 后，用胰酶消化細(xì)胞，在4 ℃下1 500 r/min離心5 min 收集細(xì)胞，每個(gè)樣用預(yù)冷的PBS 洗2次。每個(gè)樣收集約106個(gè)細(xì)胞。重懸于100～200 μL PBS 中，加入10 μL 羅丹明123（Rh123）染液（1 mg/mL）37 ℃染色10 min，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2～3 次后，重懸于PBS 中，流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。熒光強(qiáng)度的變化與對(duì)照比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺脂酸抑制HepG2 細(xì)胞增殖

MTT 試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，不同質(zhì)量濃度的白樺脂酸均可以抑制HepG2 細(xì)胞增殖，并呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。隨著白樺脂酸質(zhì)量濃度的增加，HepG2 細(xì)胞存活率在逐漸降低，說(shuō)明處理相同時(shí)間，白樺脂酸的質(zhì)量濃度越高，對(duì)HepG2 的抑制效果越強(qiáng)。結(jié)果表明，作用24，48，72 h 的白樺脂酸對(duì)于HepG2 細(xì)胞的半抑制質(zhì)量濃度分別為52，26，17.5 μg/mL，這為接下來(lái)的試驗(yàn)提供參考。

白樺脂酸作用后的細(xì)胞具有不規(guī)則的細(xì)胞巧態(tài)，如圖2b所示。而且細(xì)胞核崩裂，染色質(zhì)濃縮，這是細(xì)胞凋亡的重要特征。

圖1 HepG2 細(xì)胞存活率隨白樺脂酸質(zhì)量濃度和時(shí)間的變化Fig.1 Cell viability varied with the mass concentration of betulinic acid and time

圖2 白樺脂酸處理前、后的HepG2 細(xì)胞形態(tài)變化Fig.2 The photograph of untreated and the treated HepG2 cells at 40 μg/mL betulinic acid

2.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)白樺脂酸對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證白樺脂酸能否引起人的肝癌細(xì)胞HepG2 細(xì)胞調(diào)亡，采用流式細(xì)胞儀對(duì)白樺脂酸處理后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞經(jīng)白樺脂酸處理48 h 后，用Annexin V-FITC 和PI 染色，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果如圖3和表1所示，右下象限Annexin-V（+）/PI（-）（B4）為早期凋亡細(xì)胞群，右上象限Annexin-V（+），PI（+）（B2）為晚期凋亡細(xì)胞。由圖3可知，隨著白樺脂酸質(zhì)量濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比例也在增加，而且大部分被白樺脂酸處理過(guò)的細(xì)胞集中在B4 區(qū)域，也隨著白樺脂酸質(zhì)量濃度的增加而增加，說(shuō)明白樺脂酸主要引起的是早期凋亡。加藥的每一組凋亡率都比空白對(duì)照組高很多，如表1。說(shuō)明白樺脂酸可以有效促進(jìn)HepG2 細(xì)胞凋亡。

2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)白樺脂酸對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分布的變化也是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)。培養(yǎng)后的細(xì)胞用PI 染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期變化，結(jié)果如圖4、圖5所示。通過(guò)PI 染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2 細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)隨著白樺脂酸質(zhì)量濃度的增加，G1、G2 期的細(xì)胞比例下降，S 期的細(xì)胞比例在逐漸增加，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生了S期的阻滯。由于S 期是DNA 復(fù)制時(shí)期，即說(shuō)明白樺脂酸阻礙了HepG2 細(xì)胞的DNA 合成，從而促進(jìn)了HepG2 細(xì)胞的凋亡。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2 細(xì)胞凋亡率Table1 FCM analysis of the cell apoptosis rates of HepG2 cells

圖3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡結(jié)果圖Fig.3 FCM analysis of the cell apoptosis results

圖4 白樺脂酸對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.4 The influence of betulinic acid on cell cycle

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期結(jié)果圖Fig.5 FCM analysis of the cell cycle results

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)白樺脂酸對(duì)HepG2 線粒體膜電位的影響

細(xì)胞凋亡的早期特征之一便是線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential，MMP）的降低。通過(guò)測(cè)定線粒體膜電位，可以判斷細(xì)胞調(diào)亡是否與線粒體途徑有關(guān)[16]。染料羅丹明123（Rhodamine123）是一種可透過(guò)細(xì)胞膜的陽(yáng)離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生。用白樺脂酸處理過(guò)的HepG2 線粒體膜電位如圖6所示。發(fā)現(xiàn)隨著白樺脂酸質(zhì)量濃度的增加，線粒體膜電位越來(lái)越低，而且用白樺脂酸處理過(guò)的HepG2 線粒體膜電位與對(duì)照相比，均出現(xiàn)了明顯下降，說(shuō)明白樺脂酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡可能與線粒體途徑有關(guān)。

圖6 白樺脂酸對(duì)線粒體膜電位的影響Fig.6 The influence of betulinic acid on mitochondrial membrane potential

3 討論

本試驗(yàn)研究表明，白樺脂酸可以顯著降低HepG2 細(xì)胞的存活率，而且作用相同的時(shí)間，藥物濃度越高，對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制效果越強(qiáng)。作用24，48，72 h 的白樺脂酸對(duì)于HepG2 細(xì)胞的半抑制質(zhì)量濃度分別為52，26，17.5 μg/mL。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，白樺脂酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡主要為早期凋亡，且凋亡比例隨白樺脂酸質(zhì)量濃度的增加而增加。細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果表明白樺脂酸的加入使細(xì)胞發(fā)生了S 期的阻滯，即白樺脂酸阻礙了HepG2 細(xì)胞的DNA 合成。線粒體膜電位的研究結(jié)果表明白樺脂酸可以降低線粒體膜電位，說(shuō)明白樺脂酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能與線粒體途徑有關(guān)。

綜上所述，白樺脂酸可抑制HepG2 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡，這一機(jī)制可能與線粒體途徑有關(guān)，通過(guò)將細(xì)胞阻滯在S 期來(lái)實(shí)現(xiàn)。本試驗(yàn)結(jié)果為研究腫瘤治療藥物提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為白樺脂酸應(yīng)用于肝癌的免疫治療提供了新的試驗(yàn)依據(jù)。