廖媛媛，李濠吉 ，劉 敏

（西南醫(yī)科大學(xué)：1口腔頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室；2附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，四川瀘州 646000；3金堂縣第一人民醫(yī)院口腔科）

骨缺損一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的具有挑戰(zhàn)性的課題，患者常因創(chuàng)傷、感染或腫瘤切除致骨組織大量喪失[1]，影響功能及美觀。骨的生長(zhǎng)過程緩慢，為了加速骨愈合，近年來提出將成骨類細(xì)胞擴(kuò)增以后放入可吸收的生物支架上再植入骨缺損部位的骨修復(fù)方式[2-3]，其中有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，一為種子細(xì)胞的增殖，二為尋找適合的生物支架材料。目前發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞因子或者藥物具有促進(jìn)細(xì)胞增殖及成骨的作用，如骨形成蛋白（BMP）、濃縮生長(zhǎng)因子（CGF)等[4-5]。近年來國(guó)外不斷有研究報(bào)道了鋰鹽能通過調(diào)控經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路來發(fā)揮成骨作用，可用于治療骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨折愈合［6-9］。而國(guó)內(nèi)鮮有關(guān)于鋰鹽成骨的相關(guān)報(bào)道，其作用細(xì)胞成骨的最佳劑量在國(guó)外文獻(xiàn)中也不盡相同。作為一種新發(fā)現(xiàn)具有一定潛力的促成骨物質(zhì)，它對(duì)細(xì)胞的影響與成骨的能力仍然值得探索。

在有足夠多細(xì)胞的前提下，尋找一種能提供細(xì)胞生長(zhǎng)的三維空間的生物支架材料越來越受到人們重視。RADA16-I是由Zhang等[10]設(shè)計(jì)出的多肽類水凝膠，它在溶液中能形成穩(wěn)定的β-sheet二級(jí)結(jié)構(gòu)，不與生物體發(fā)生排斥反應(yīng)，能提供細(xì)胞賴以生存的三維空間，且能為細(xì)胞提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[11-13]。本實(shí)驗(yàn)首次將氯化鋰與RADA16-I聯(lián)合使用，觀察二者共同使用是否更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖及成骨，為臨床對(duì)骨缺損的修復(fù)以及骨增量手術(shù)提供新的修復(fù)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

MC3T3-E1成骨細(xì)胞株（武漢普諾賽生物）；無水氯化鋰LiCl（Solarbio，USA）；CCK-8試劑盒（Dojindo，中國(guó)）；ALP檢測(cè)試劑盒（Solarbio，USA）；Triton X-100（Solarbio，USA）；CKX41-A32PH倒置生物顯微鏡（Olympus，Japan）；KDC-1044低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Synergy2酶標(biāo)儀（基因科技有限公司,中國(guó)）；RADA16-Ⅰ凍干粉（海波泰生物有限公司；總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；PrimeScript RT reagent Kit（寶生物工程（大連）有限公司）；SYBR Premix Ex Taq II Kit（寶生物工程(大連)有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量（USA）；掃描電子顯微鏡S-450（Hitachi，Japan）。

1.2 溶液配制

RADA16-Ⅰ多肽水凝膠的配置：RADA16-Ⅰ干粉使用去離子水溶解，終濃度為1%(wt/vol)。取上述溶液1 mL，加入PBS，超聲混勻1 min,37℃恒溫箱靜置30 min。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC3T3-E1細(xì)胞消化，制成密度為5×104/mL的細(xì)胞懸濁液。每孔100μL接種于96孔板中。對(duì)照組用含5%的FBS培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組用含5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L LiCl的 5%FBS培養(yǎng)基，每組6個(gè)復(fù)孔，分別于1、2、3 d加入CCK-8反應(yīng)2 h，測(cè)定450 nm吸光度值，確定LiCl最佳濃度。

1.4 ALP分泌活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以密度為2×105/mL接種于48孔板內(nèi)，每孔500 μL，加不同濃度LiCl，每組5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)5 d后，吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗，加入20 μL 0.5%TritonX-100，4 ℃放置過夜后震蕩，裂解離心后置于96孔板中，根據(jù)ALP檢測(cè)試劑盒中說明書，加入試劑反應(yīng)，在520 nm波長(zhǎng)讀取OD值，計(jì)算ALP活性。

1.6 RT-PCR檢測(cè)OSX、Runx2表達(dá)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的小鼠前成骨細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以1×106/mL的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，對(duì)照組細(xì)胞無任何處理，LiCl組加入5 mmol/L的LiCl溶液，實(shí)驗(yàn)組加入載LiCl的RADA16-I水凝膠，Trizol提取總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟合成cDNA，本實(shí)驗(yàn)反轉(zhuǎn)錄引物名稱及序列見表1，RT-PCR反應(yīng)體系為蒸餾水6.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，樣品cDNA2 μL，Taq酶10 μL。RT-PCR檢測(cè)OSX、Runx2 mRNA表達(dá)量。利用2-△△CT法對(duì)OSX、Runx2基因表達(dá)量進(jìn)行分析。

表1PCR引物

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)采用One-wayANOVA單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 RADA16-I多肽水凝膠的性狀觀察

無流動(dòng)性的凝膠狀態(tài)，見圖1。電鏡下可見其內(nèi)部呈多孔的三維立體結(jié)構(gòu)，孔隙大小均一，表面結(jié)構(gòu)凹凸有致，有利于細(xì)胞的附著，見圖2。

圖1 RADA16-I的水凝膠

圖2RADA16-I掃描電鏡圖

2.2 CCK8法檢測(cè)各組濃度LiCl作用下細(xì)胞活力變化

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，細(xì)胞活力在第1 d內(nèi)5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L濃度組無明顯增高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在隨后的第2 d和第3 d，5 mmol/L、10 mmol/L LiCl均表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖促進(jìn)作用，且5 mmol/L促進(jìn)作用強(qiáng)于10 mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而20 mmol/L下的細(xì)胞數(shù)量則出現(xiàn)一定程度上的停止甚至減少，40 mmol/L細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞活力大大降低（P ＜0.05）,見表2。

表2 各組濃度LiCl對(duì)細(xì)胞活力影響

2.3 ALP活性

5 mmol/LLiCl組對(duì)細(xì)胞ALP活性的促進(jìn)作用強(qiáng)于其余組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而10 mmol/L與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20 mmol/L（P ＜ 0.05）和40 mmol/L（P ＜ 0.05）均表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞ALP活性抑制作用，見表3。

表3 ALP活性檢測(cè)結(jié)果

2.4 RT-PCR檢測(cè)OSX、Runx2表達(dá)

OSX、Runx2基因表達(dá)水平LiCl組和實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組都有增加。實(shí)驗(yàn)組的OSX及Runx2表達(dá)量較LiCl組要高（P ＜ 0.05），見表4。

表4 OSX Runx2基因表達(dá)量（±s）

表4 OSX Runx2基因表達(dá)量（±s）

注：a與對(duì)照組相比，P＜ 0.05；b與LiCl組相比，P＜ 0.05

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組LiCl組OSX基因1.013±0.210 2.840±0.295ab 1.707±0.132a 52.977 0.000 F P Runx2基因1.007±0.160 2.600±0.272ab 1.427±0.138a 53.667 0.000

3 討 論

鋰鹽是近年來發(fā)現(xiàn)的具有成骨作用的藥物，鋰鹽促進(jìn)細(xì)胞增殖的濃度，目前國(guó)外研究報(bào)道的差異較大，但總體測(cè)試濃度位于50 mmol/L以內(nèi)[14-18]。鑒于使用細(xì)胞品種不同及所用試劑的差異，且目前國(guó)內(nèi)鮮有關(guān)于鋰鹽對(duì)小鼠MC3T3-E1成骨作用的基礎(chǔ)研究，本次研究則選擇該細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討鋰鹽對(duì)其增殖及成骨能力的影響。LiCl濃度在5 mmol/L時(shí)，能顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，10 mmol/L雖然同樣也能促進(jìn)細(xì)胞增殖但無5 mmol/L明顯，二者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著劑量增加，在20 mmol/L濃度下LiCl表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的抑制作用，同對(duì)細(xì)胞增殖的影響相似，LiCl對(duì)細(xì)胞成骨向分化的作用也是雙向的。本次研究中發(fā)現(xiàn)鋰鹽濃度在5 mmol/L與其余三組濃度比較能最大程度的促進(jìn)細(xì)胞增殖與成骨，可選用該濃度作為下一部分實(shí)驗(yàn)濃度。但鑒于實(shí)驗(yàn)中所選濃度的局限性與作用時(shí)間關(guān)系，并不能完全認(rèn)為該濃度為促進(jìn)細(xì)胞增殖的最適濃度。關(guān)于LiCl作用濃度一直存在爭(zhēng)議[19-20]。究其原因，可能與LiCl成骨機(jī)制及外部條件有關(guān)。目前相關(guān)研究表明LiCl成骨機(jī)制主要是調(diào)控Wnt信號(hào)通路，該通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化的主要途徑，而對(duì)于該機(jī)制目前仍在繼續(xù)研究中[11]。

組織生物工程中支架材料是指能與活體細(xì)胞結(jié)合并植入生物體不同組織，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化的一類生物材料。國(guó)外一項(xiàng)Meta分析表明，細(xì)胞是否加載生物支架，結(jié)果差異明顯，通過將成骨細(xì)胞添加到生物材料支架中，可以提高種植體周圍骨的再生和骨整合[21]。在制備1%（W/V）RADA16-I水凝膠過程中發(fā)現(xiàn)，RADA16-I溶液的流動(dòng)性與水無明顯差異。通過鹽溶液觸發(fā)的自組裝行為，溶液在較短的時(shí)間內(nèi)形成凝膠狀物質(zhì)，體積無明顯變化，能黏附在管底不脫落，這使得在修復(fù)骨缺損類模型中，加入的水凝膠不會(huì)因體位變化或關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)而大量流失。臨床上骨缺損常不規(guī)則，有時(shí)甚至位于肉眼不可見或者充填器械無法達(dá)到的深處，RADA16-I水凝膠前期的流動(dòng)性可使得它能適應(yīng)各種不規(guī)則形態(tài)充滿骨缺損的每個(gè)角落，隨后立馬凝膠化維持形態(tài)，使藥物能持續(xù)作用周圍成骨細(xì)胞。通過觀察，RADA16-I形成凝膠的時(shí)間在30 min以內(nèi)，不至于因形成時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致液體大量流失使成骨效果大打折扣。

RADA16-I單獨(dú)使用即可促進(jìn)細(xì)胞增殖，還能誘導(dǎo)細(xì)胞成骨向分化，使成骨活動(dòng)更加活躍，也可作為支架材料或載藥緩釋系統(tǒng)使用。文獻(xiàn)報(bào)道，RADA16-I能對(duì)新西蘭兔髂骨缺損模型起到止血及加速成骨的雙重作用[22]。本次研究中第一部分選取了一個(gè)能促進(jìn)細(xì)胞增殖及成骨的LiCl濃度值，再將該濃度下的LiCl加入到RADA16-I中共同培養(yǎng)細(xì)胞4 d后，通過real-time PCR對(duì)提取的OSX、Runx2 mRNA定量分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)負(fù)載LiCl的RADA16-I成骨細(xì)胞相關(guān)特異性轉(zhuǎn)錄因子OSX、Runx2表達(dá)量較單獨(dú)使用LiCl增加（P＜0.01），這提示了二者聯(lián)合使用比單獨(dú)LiCl處理對(duì)細(xì)胞成骨作用更明顯。

骨組織的愈合本身是一個(gè)相對(duì)漫長(zhǎng)的過程，完全愈合一般需要3～6個(gè)月甚至更久，多肽水凝膠本身為氨基酸易被機(jī)體代謝，而本次實(shí)驗(yàn)所選擇的作用時(shí)間也相對(duì)較短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以表明負(fù)載LiCl的RADA16-I能促進(jìn)細(xì)胞早期成骨，對(duì)于遠(yuǎn)期效果目前無法確定，但有相關(guān)研究對(duì)SD大鼠股骨缺損模型應(yīng)用RADA16-I，觀察到8周、12周的骨缺損周圍新骨生成較PBS治療組高[23]，由此可見，多肽水凝膠的遠(yuǎn)期成骨效果仍值得期待。

4 結(jié) 論

LiCl及載LiCl的RADA16-I均能提高OSX、Runx2表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞成骨。但載LiCl的RADA16-I較單獨(dú)使用LiCl成骨相關(guān)基因的表達(dá)更顯著，成骨效果更佳。