(1.玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；2.玉溪飛熊農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，云南 玉溪 653100)

大花胡麻草CentrantheragrandifloraBenth.為玄參科胡麻草屬植物，主要分布于云南、貴州、廣西等地[1～3].大花胡麻草的藥用部位為根，具有活血調(diào)經(jīng)、散瘀止痛、凝血、抗菌、抗癌的作用，主要用于治療閉經(jīng)、痛經(jīng)、崩漏、跌打損傷、風(fēng)濕骨痛、外傷出血、心腦血管疾病等[1,3～7].目前，關(guān)于大花胡麻草的研究較少，且主要集中于化學(xué)成分的分離鑒定和初步藥理作用方面.大花胡麻草主要藥效成分為環(huán)烯醚萜類化合物、苯乙醇苷類化合物和杜鵑紅素[3].要通過合成生物學(xué)手段生產(chǎn)藥用成分，必須先弄清藥用成分的生物合成途徑.

在植物中，環(huán)烯醚萜類化合物的生物合成途徑是通過質(zhì)體2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑和胞質(zhì)中甲羥戊酸(MVA)途徑，生成異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)合成的[8].3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR，EC：1.1.1.34)能夠催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A生成MVA，是萜類合成MVA途徑中的第一個限速酶，也是細(xì)胞質(zhì)萜類化合物的代謝中的重要調(diào)控點[9].目前，HMGR基因已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[10]、長春花(Catharanthusroseus)[11]、丹參(Salviamiltiorrhiza)[12]、珠子參(Panaxjaponicus)[13]、滇重樓(Parispolyphylla)[14]、銀杏(Ginkgobiloba)[9,15]等多種植物中被克隆出來.研究表明，在植物細(xì)胞中過表達(dá)HMGR基因能夠提高萜類物質(zhì)的含量.在青蒿中過表達(dá)長春花CrHMGR基因使青蒿素含量提高22.5%-38.9%[16,17].在雷公藤懸浮細(xì)胞中過表達(dá)TwHMGR基因分別使二萜雷公藤甲素及三萜雷公藤紅素含量提高63.93%和90.04%[18].在珠子參中過表達(dá)PjHMGR基因，導(dǎo)致皂苷含量增加2.5倍[13].因此，挖掘大花胡麻草中CgHMGR基因，并通過在大花胡麻草中過表達(dá)CgHMGR基因來提高其根部萜類含量具有巨大的潛在價值.

本研究擬根據(jù)大花胡麻草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(BioProject：PRJNA558809)中CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3基因序列，分別設(shè)計基因特異性引物，通過RT-PCR的方法對CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3基因進(jìn)行克隆、序列分析、原核表達(dá)載體構(gòu)建和原核表達(dá)，為CgHMGR基因功能的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

大花胡麻草植株采自于玉溪飛熊農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司玉山城基地，采樣日期為2018年11月3日，由玉溪飛熊農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司技術(shù)人員鑒定為CentrantheragrandifloraBenth.取3株健康、形態(tài)大小和生長勢基本相同的一年生栽培大花胡麻草，分別剪取根、莖、葉和花，錫箔紙包被后，進(jìn)行標(biāo)記，然后投入液氮中保存.

1.2 方 法

葉片總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄按照文獻(xiàn)[19]的方法，分別進(jìn)行大花胡麻草根、莖、葉和花的總RNA提取、檢測和逆轉(zhuǎn)錄.

表1 本研究所用到的引物

續(xù)表1

CgHMGR基因的生物信息學(xué)分析參照張曉東等的方法進(jìn)行生物信息學(xué)分析[20].使用德泰生物科技(南京)有限公司在線軟件(http://www.detaibio.com/tools/codon-adaptation-index-calculator.html)進(jìn)行密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaption Index，CAI)分析.

CgHMGR基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建挑選CgHMGR2基因進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建.使用限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI分別對19T-CgHMGR2質(zhì)粒和pColdTMProS2質(zhì)粒(Takara，日本)進(jìn)行雙酶切，膠回收后，進(jìn)行電泳檢測,然后按照基因：載體=3∶1的摩爾比進(jìn)行過夜連接.次日，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109后，涂布于LB + Amp平板.37℃培養(yǎng)過夜，挑取白色菌斑，接種于LB + Amp的液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng).第三日，使用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒提取.接著，進(jìn)行酶切檢測，20 μl反應(yīng)體系為：HindIII 1 μl、XhoI 1 μl、10 × buffer 2 μl、質(zhì)粒 2 μl、ddH2O 14 μl，同時設(shè)置不加酶的陰性對照.過夜反應(yīng)后，使用1%瓊脂糖凝膠檢測.檢測正確后，取1 ml菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA測序，確?；蛐蛄姓_并且在原核表達(dá)載體上沒有發(fā)生移碼現(xiàn)象.

CgHMGR2基因的qPCR分析參照文獻(xiàn)[19]的方法，進(jìn)行CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3基因的qPCR分析.以轉(zhuǎn)錄組中CgUbiquitin基因(下文簡稱CgUbi，GenBank登錄號MK256646)作為內(nèi)參設(shè)計引物qCgUbi-F和qCgUbi-R(表1)，PCR產(chǎn)物長度為152 bp.根據(jù)CgHMGR基因序列分別設(shè)計基因特異性引物(表1).使用嵌合熒光檢測試劑盒TB GreenTMPremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)(Takara，大連)進(jìn)行qPCR，PCR條件為：95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s.每個反應(yīng)重復(fù)3次.反應(yīng)在LightCycler? 480 II熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線由定量PCR儀軟件自動生成.使用內(nèi)參基因CgUbi表達(dá)校準(zhǔn)后，軟件采用比較Ct值的“2-ΔΔCt”的方法自動計算出根、莖、葉中CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3基因相對表達(dá)量.

2 結(jié)果與分析

2.1 CgHMGR基因的克隆

以大花胡麻草葉cDNA為模板，分別使用基因特異性引物對CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均擴(kuò)增出約2 000 bp的條帶(圖1).然后分別進(jìn)行TA克隆和DNA測序.

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn).1～3：CgHMGR3、CgHMGR2和CgHMGR1基因的PCR結(jié)果.圖1 CgHMGR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 CgHMGR基因的生物信息學(xué)分析

利用Genetyx和DNAMAN軟件對CgHMGR基因cDNA序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3基因開放閱讀框全長分別為1 674、1 680和1 710 bp，分別編碼557、559和570個氨基酸(表2).使用NCBI網(wǎng)站提供的BankIt軟件將該序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號MH794261、MH794263和MH794256.

表2 CgHMGR蛋白的理化性質(zhì)

使用Genetyx軟件將CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3基因的核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)，然后使用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTp程序?qū)gHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白的氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，結(jié)果表明CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白都具有I類HMG-CoA還原酶保守結(jié)構(gòu)域、催化位點、NADP(H)結(jié)合位點(圖2)、底物結(jié)合口袋、抑制劑結(jié)合位點、四聚體界面，都屬于HMG-CoA還原酶超家族成員，且 CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白與獨角金SaHMGR1相似性最高，分別達(dá)到91.64%、90.39%和88.79%.利用Mega X將CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白氨基酸序列與文獻(xiàn)已報道的部分序列、BLASTp結(jié)果中的相似性較高的部分序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示大花胡麻草CgHMGR1和CgHMGR2蛋白與獨角金SaHMGR1和SaHMGR2蛋白處于同一進(jìn)化枝，CgHMGR3與樹棉GaHMGR、陸地棉GhHMGR、蘋果MdHMGR、月季RcHMGR蛋白處于同一進(jìn)化枝(圖3)，表明它們親緣關(guān)系較近.

圖2 中，黑色-相似性等于100%；粉紅色-75%≤相似性<100%；淺藍(lán)色-50%≤相似性<75%；保守氨基酸基序使用下劃線標(biāo)出；催化重要的氨基酸使用紅色框標(biāo)出.

圖2 CgHMGR蛋白與其它植物HMGR蛋白的多序列比對結(jié)果

圖3 CgHMGR蛋白與其它植物中HMGR蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

使用ExPASy ProtParam軟件對CgHMGR蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白單體相對分子質(zhì)量約為60.00 kD，CgHMGR1、CgHMGR2蛋白理論等電點相近，而CgHMGR3的理論等電點較低，與其帶帶負(fù)電氨基酸殘基(Asp + Glu)較多有關(guān)(見表1).CgHMGR1、CgHMGR2蛋白不穩(wěn)定指數(shù)較高，為不穩(wěn)定蛋白，而CgHMGR3的不穩(wěn)定指數(shù)較低，為穩(wěn)定蛋白；CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3的脂肪指數(shù)和總平均疏水性相似，均為疏水蛋白(表1).CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白均含有20種基本氨基酸，其中CgHMGR1、CgHMGR2蛋白中含量最高的三種氨基酸分別為絲氨酸(10.60%、10.60%)、亮氨酸(10.40%、10.00%)和丙氨酸(8.40%、8.40%)，而CgHMGR3蛋白含量最高的三種氨基酸分別為亮氨酸(10.00%)、苯丙氨酸(9.80%)和絲氨酸(9.80%)，CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白含量最低的氨基酸均為色氨酸(0.4%、0.5%、0.4%).

利用SSpro軟件對CgHMGR蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋(H)分別占39.68%、40.43%和42.11%，β折疊(E)分別占17.41%、17.35%和18.07%，無規(guī)則卷曲(C)分別占39.68%、42.22%和39.82%(表3).

利用Swiss-Model Workspace使用自動模式預(yù)測CgHMGR蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4.CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白模型均以3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶[1dq9.1.C]為模板，分別在第140～541、142～543和155～556氨基酸處建模，三維模型覆蓋率分別為75.00%、75.00%和63.00%，序列一致性為55.16%、55.16%和55.90%.

表3 CgHMGR蛋白的其它性質(zhì)

InterPro軟件可在結(jié)構(gòu)域水平上對功能未知的蛋白進(jìn)行注釋，使用InterPro在線工具對CgHMGR蛋白進(jìn)行分析和歸類，結(jié)果表明CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白均包含HMGR結(jié)構(gòu)域(IPR002202)，屬于I類HMGR家族成員.分別對CgHMGR蛋白進(jìn)行GO注釋，結(jié)果表明CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白均參與氧化還原過程(GO:0055114)、輔酶A代謝過程(GO:0015936)和類異戊二烯生物合成過程(GO:0008299)；它們的分子功能均為輔酶結(jié)合(GO:0050662)、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(NADPH)活性(GO:0004420)、作用于以NAD或NADP為受體、以CH-OH官能團(tuán)為供體的氧化還原酶活性(GO:0016616)和蛋白結(jié)合(GO:0005515).

紅色-α-螺旋,黃色-β-折疊,綠色-環(huán);A:CgHMGR1,B:CgHMGR2,C:CgHMGR3圖4 CgHMGR蛋白同源二聚體的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SignalP 5.1服務(wù)器對CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白進(jìn)行分析，均未發(fā)現(xiàn)信號肽，表明該蛋白為非分泌型蛋白.利用TMHMM軟件預(yù)測CgHMGR蛋白的跨膜螺旋區(qū)，結(jié)果表明CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白在N端均含有2個跨膜螺旋區(qū)域(圖5)，為膜蛋白.使用ProtComp 9.0和Plant-mPLo軟件對CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng).使用WoLF PSORT軟件對CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果為對CgHMGR1可能定位于葉綠體、細(xì)胞質(zhì)或線粒體，而CgHMGR2最可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或質(zhì)膜，CgHMGR3蛋白可能定位于質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng).使用ChloroP 1.1 Server對CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)運肽進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明它們不含葉綠體轉(zhuǎn)運肽(表4).

表4 CgHMGR蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測

圖5 CgHMGR蛋白可能跨膜螺旋的檢測

密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)是指編碼區(qū)同義密碼子與最佳密碼子使用頻率的相符程度，取值在0～1之間.CAI可以用來評估外源基因在宿主內(nèi)的表達(dá)水平，CAI越高，則外源基因在宿主內(nèi)的表達(dá)水平越高.對CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3基因進(jìn)行稀有密碼子分析，結(jié)果表明CgHMGR1、CgHMGR1和CgHMGR3基因在大腸桿菌中的CAI分別為0.59、0.58和0.60，在釀酒酵母中的CAI分別為0.57、0.58和0.57.因此，可選用大腸桿菌表達(dá)菌或釀酒酵母進(jìn)行原核表達(dá).

2.3 CgHMGR2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

分別對質(zhì)粒19T-CgHMGR2和原核表達(dá)載體載體ProS2進(jìn)行HindIII和XhoI雙酶切，然后進(jìn)行膠回收，再將基因和載體進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌、搖菌后，然后對菌液中的質(zhì)粒進(jìn)行提取，并使用HindIII和XhoI雙酶切檢測，結(jié)果如圖6，能夠切出目的基因CgHMGR2和載體ProS2，且大小正確.DNA測序結(jié)果表明CgHMGR2基因無突變、無移碼現(xiàn)象.

圖6 原核表達(dá)載體ProS2-CgHMGR2的雙酶切檢測結(jié)果

2.4 CgHMGR2基因的qPCR分析

取一年生大花胡麻草的根、莖、葉和花，通過qRT-PCR分析CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3基因在不同組織中的表達(dá)情況.結(jié)果表明，CgHMGR1基因在花中的表達(dá)量最高，其次是莖，再次是根，在葉中表達(dá)量最低；CgHMGR2基因在莖中表達(dá)量最高，其次是根，再次是花，在葉中的表達(dá)量最低；CgHMGR3基因在莖中表達(dá)量最高，其次是花，再次是葉和根(圖7).從不同器官來看，在花和莖中CgHMGR1基因起主要作用，在葉中CgHMGR3起主要作用，而在根中三個基因均起作用(圖7).

圖7 CgHMGR基因在根、莖、葉和花中的相對表達(dá)

其中,圖7使用Excel2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差,數(shù)據(jù)來自3次獨立重復(fù)實驗.

3 討 論

環(huán)烯醚萜類是大花胡麻草的主要藥效成分之一，而HMGR基因能夠調(diào)控萜類的生物合成，因此HMGR基因備受學(xué)者們的關(guān)注.LI W.等通過對14個陸生植物基因組中56個HMGR基因的研究結(jié)果表明，6種藻類基因組中不含HMGR基因；HMGR基因和HMGR蛋白的結(jié)構(gòu)在所有植物中高度保守；植物HMGR基因起源于一個祖先HMGR基因，最終在植物中分化為4個不同的組，包括單子葉植物中的2組和雙子葉植物中的2組；物種特異性的HMGR基因重復(fù)主要是由片段重復(fù)引起的，并且HMGR基因的功能分化非常有限[21].因此，HMGR基因在植物界高度保守.基于前人的研究結(jié)果，本課題組使用序列比對的方法，從大花胡麻草根、莖和葉轉(zhuǎn)錄組中挖掘出9個CgHMGR基因，本研究對其中的CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3基因進(jìn)行克隆、序列分析和原核表達(dá)載體構(gòu)建.序列比對分析結(jié)果表明，CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白都具有I類HMG-CoA還原酶保守結(jié)構(gòu)域、催化位點、NADP(H)結(jié)合位點、底物結(jié)合口袋、抑制劑結(jié)合位點、四聚體界面，都屬于HMG-CoA還原酶超家族成員，且 CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白與獨角金SaHMGR1相似性均超過88%.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明大花胡麻草CgHMGR1和CgHMGR2蛋白與獨角金SaHMGR1和SaHMGR2蛋白處于同一進(jìn)化枝，CgHMGR3與樹棉GaHMGR和陸地棉GhHMGR等處于同一進(jìn)化枝.GO注釋結(jié)果表明CgHMGR1、CgHMGR2和CgHMGR3蛋白均參與氧化還原過程、輔酶A代謝過程和類異戊二烯生物合成過程.因此，本研究所克隆的序列為CgHMGR基因.

弄清HMGR基因的表達(dá)模式是解析其功能的重要前提.通常植物HMGR基因都存在多個成員，且不同成員在不同組織中存在差異表達(dá)，因此能夠調(diào)控不同組織MVA途徑.在小?？Х?(Coffeaarabica)中，CaHMGR1僅在花芽、葉和發(fā)育初期的果實中表達(dá)，而CaHMGR2在果實發(fā)育階段所有組織中均表達(dá)[22].在長春花中，CrHMGR1基因在莖尖表達(dá)量最高，其次是葉，在莖和根中幾乎不表達(dá)；CrHMGR2和CrHMGR3基因在除莖尖外的所有組織中的表達(dá)量均較低[23].在花期滇龍膽(Gentianarigescens)中，GrHMGR主要在根中表達(dá)，在葉和花中的表達(dá)量很低[24].在北柴胡(Bupleurumchinense)中，BcHMGR基因在根中的表達(dá)量最高，在莖、葉和果中的表達(dá)量均較低[25].在滇重樓中，PpHMGR基因在根中表達(dá)量最高，在芽和莖中也有少量表達(dá)，在葉中不表達(dá)[14].在油樟中，CcHMGR1在根中表達(dá)量最高，其次是葉和枝；而CcHMGR2主要在根和葉中表達(dá)，在枝中的表達(dá)量較低[26].在本研究中，CgHMGR1基因在花中的表達(dá)量最高，其次是莖，表達(dá)量最低的是葉；CgHMGR2和CgHMGR3基因在根、莖、葉和花中的總體表達(dá)量較低，其表達(dá)量為莖 > 根 > 葉.這些結(jié)果表明,CgHMGR1基因可能在環(huán)烯醚萜類合成中起主要作用，或者是MEP途徑而不是MVA途徑在環(huán)烯醚萜生物合成中起重要作用，而這需要通過進(jìn)一步的實驗來驗證.