馬培澤，孫正新2，楊 春，姜月華3，呂 娟

細胞在應激狀態(tài)下，適度的自噬能夠促進細胞自我吞食，保護細胞抵抗不利環(huán)境，促進細胞存活，而過度自噬則誘導細胞走向程序性死亡[1-4]。心肌缺血時，自噬活性的改變很可能影響血管內皮的結構和功能，而血管內皮細胞功能改變與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，因此，研究自噬在缺血心肌微血管內皮細胞(CMECs)缺血損傷中的作用，將有助于發(fā)現(xiàn)新的方法應用于缺血性疾病的治療。過去的研究多集中于對心肌細胞的保護，而忽視了對CMECs缺血損傷的關注。迄今為止，自噬在缺血CMECs的作用尚未明確，基于細胞自噬探討中醫(yī)藥保護血管內皮的作用，鮮見報道。鑒于此，本課題在原有研究基礎上，建立缺血CMECs模型，基于細胞自噬探討中醫(yī)藥保護血管內皮的干預效應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用SPF級6周齡雄性SD大鼠，體重220～280 g，45只，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。所有大鼠均采用籠養(yǎng)，生存在明暗各12 h飼養(yǎng)環(huán)境中。

1.2 主要儀器 流式細胞儀(德國Beckman公司)，酶標儀(美國Thermo Scientific公司)，低溫高速離心機(美國Thermo Scientific公司)，透射電鏡(日本JEOL公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Heraeus公司)，心電圖機(北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司)，呼吸機(美國BIRD公司)，BIO-RAD電泳儀(美國BIO-RAD公司)，Axiovert 40C倒置相差顯微鏡(德國Zeiss公司)，BIO-RAD半干轉膜儀(美國BIO-RAD公司)，LAS-4000型化學發(fā)光及熒光影像分析儀(日本FUJIFILM公司)。

1.3 藥品與試劑 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(杭州聯(lián)科生物有限公司)，3甲基腺嘌呤(3-MA，美國Sigma-Aldrich)，雷帕霉素(美國Cell Signal Technology)，祛風生脈顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，PBS平衡液(上海碧云天生物技術有限公司)，0.25%胰蛋白酶(北京Solarbio公司)，Western-blot所用試劑(北京Solarbio公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物灌胃及血清制備 選取雄性SD大鼠(220～280 g)5只。祛風生脈顆粒2 g/(kg·d)，每只大鼠每日上午灌胃1 次，每次4 mL，連續(xù)5 d。于第5日末次灌胃3 h 后打開腹腔，在大鼠腹主動脈插管，無菌取血，置無菌不抗凝管中，室溫下靜置3～4 h，1 500 r/min離心20 min，吸上清液，無菌分離血清并混合，過濾后置于無菌試管中，制備成祛風生脈顆粒大鼠含藥血清，于-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 大鼠急性心肌梗死模型建立 選取雄性SD大鼠(220～280 g)32只，采用結扎法制作大鼠急性心肌梗死模型[5]。記錄心電圖出現(xiàn)Q波、ST段抬高、T波高聳或倒置，證實結扎成功。術后存活24 h即為造模成功。

1.4.3 培養(yǎng)大鼠缺血/正常CMECs 選取造模成功的急性心肌梗死模型大鼠32只及正常SD大鼠8只，采用組織塊法分別培養(yǎng)大鼠缺血/正常CMECs[5]。組織塊周圍培養(yǎng)出大量細胞，去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d換液1次，直到細胞生長至近融合時進行傳代，實驗均選取二代細胞進行。

1.4.4 分組及藥物干預 將成功培養(yǎng)的大鼠缺血CMECs隨機分為4組：缺血組(QX組)、缺血+雷帕霉素組(QX+RAPA組)、缺血+3-甲基腺嘌呤組(QX+3-MA組)和缺血+祛風生脈顆粒組(QX+QF組)。并將正常大鼠CMECs作為正常組(ZC組)。QX組和ZC組細胞均給予含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，QX+RAPA組在上述培養(yǎng)基基礎上，加入濃度為10 nmol/L的自噬促進劑雷帕霉素，QX+3-MA組加入濃度為5 mmol/L的自噬抑制劑3-MA，QX+QF組給予祛風生脈顆粒大鼠含藥血清，與缺血CMECs共孵育，培養(yǎng)24 h。

1.5 觀察指標及測定方法

1.5.1 透射電鏡觀察自噬小體 取各組處于對數(shù)生長期的細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞長滿培養(yǎng)瓶底的80%，消化、離心，小心吸取上清液，向細胞團塊中緩緩加入1.5 mL 3%戊二醛固定液進行固定，4 ℃保存，后進行雙固定、脫水、浸透、包埋、切片，調試電鏡，觀察自噬小體以及細胞超微結構變化。

1.5.2 Western-blot分析LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62蛋白表達 與上述分組一樣，分別取5組生長至對數(shù)生長期的細胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入細胞裂解液，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度[3]，根據(jù)總上樣量和各組樣本蛋白濃度計算各組樣本所需樣本量。將樣品液和預染蛋白標記分別上樣，電泳分離蛋白，參照半干轉膜儀說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，轉印蛋白，于5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結合，封閉過的膜加入合適濃度一抗，抗原抗體結合，4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的二抗以結合一抗，室溫孵育1 h，加入顯色劑，膜與化學發(fā)光底物孵育，應用LAS-4000型化學發(fā)光及熒光影像分析儀曝光顯影，圖片掃描。應用Gel-Pro軟件分析數(shù)字化圖像上每個特異條帶的灰度值。各組樣本目的蛋白的灰度值除以內參的灰度值以校正誤差，所得數(shù)值為各組樣本目的蛋白的相對含量。

1.5.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 0.25%胰酶消化細胞，將每個樣本細胞數(shù)調整為1×106～5×106個，1000r/min離心5min，棄上清，PBS洗滌2次，1000 r/min離心5 min，棄上清，每個樣本用約500 μL的1×Binding Buffer重懸細胞；每個樣本中分別加入5 μL的Annexin V-FITC和106的PI；避光搖勻后黑暗中室溫孵育5 min；1 h內通過流式細胞儀檢測分析結果。

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測一氧化氮(NO)、內皮素-1(ET-1) 加藥干預后用無菌EP管收集各組細胞培養(yǎng)上清液，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書稀釋標準品。取5支干凈的EP管，并于每管中加入150 μL的標準品稀釋液，分別設空白孔(不加樣，只加顯色劑A、B和終止液)、標準孔、待測樣品孔和零孔(將其作為標曲的最后一個點)，并做記錄。標準品孔：每孔加入制備好的標準品50 μL，后加入生物素抗原工作液50 μL。樣品孔：先加入相應大鼠血清樣品50 μL，后加入生物素抗原工作液50 μL。零孔：先加入標準品/樣品稀釋液50 μL，后加入生物素抗原工作液50 μL。以上各孔均做好相應記錄，輕輕搖晃后貼上封板膜，置于37 ℃恒溫箱中60 min。輕輕揭掉封板膜，棄去液體，甩干，放入洗板機內洗板，洗板5次后取出酶標板，拍干。每孔中先后分別加入顯色劑A 50 μL、顯色劑B 50 μL，小心搖晃，置于37 ℃保溫箱中避光10 min。取出酶標板，每孔加入終止液50 μL以終止反應(藍色立即轉為黃色)。將酶標板放入酶標儀中，以空白孔調零，波長為450 nm測量各孔的吸光度值(此步驟應于10 min內進行)。根據(jù)標準品的濃度和吸光度值計算出標準曲線回歸方程，在此基礎上根據(jù)樣品的吸光度值計算出不同樣品所對應的濃度。

2 結 果

2.1 透射電鏡觀察各組細胞自噬小體及超微結構變化 透射電鏡下，ZC組細胞質均勻，細胞內空泡少，核染色質均勻分布；QX組細胞質內可以見到大小不等的雙層膜或多層膜自噬體結構，線粒體形態(tài)腫脹變形；QX+RAPA組自噬體的聚集趨于增多，自噬體中包含部分細胞質成分，QX+3-MA組自噬體數(shù)目明顯減少。QX+QF組自噬小體聚集更加明顯，同時還觀察到數(shù)目較多的自噬溶酶體，自噬溶酶體中包含部分胞質成分以及尚未消化的細胞器。詳見圖1。

A為ZC組；B為QX組；C為QX+RAPA組；D為QX+3-MA組；E為QX+QF組。圖中白色箭頭所示為核仁，黑色實心箭頭所示為自噬小體，黑色空心箭頭所示為自噬溶酶體

2.2 各組細胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值情況比較 Western blot 結果表明：QX組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值高于ZC組和QX+3-MA組(P<0.05)；與QX組和QX+3-MA組比較，QX+RAPA組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值進一步升高(P均 <0.05)，與QX組相比，QX+QF組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高(P<0.01)。詳見表1。

表1各組細胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值情況(±s)

與ZC組比較，1)P<0.05；與QX組比較，2)P<0.05；與QX+3-MA組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

2.3 各組細胞凋亡情況比較 QX組總凋亡率高于ZC組(P<0.05)；與QX組和QX+3-MA組比較，QX+RAPA組總凋亡率明顯降低(P均<0.05)，與QX組相比，QX+QF組總凋亡率顯著降低(P<0.01)。詳見圖2、表2。

圖2流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

表2各組CMECs凋亡情況比較(±s) %

與ZC組比較，1)P<0.05； 與QX組比較，2)P<0.05；與QX+3-MA組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

2.4 各組細胞內皮功能變化 QX組ET-1水平比ZC組升高(P<0.01)；QX+RAPA組ET-1水平比QX組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；QX+3-MA組ET-1水平比QX組升高(P<0.05)；QX+QF組ET-1水平比QX組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。QX組NO水平比ZC組升高(P<0.01)；QX+RAPA組NO水平比QX組降低(P<0.05)；QX+3-MA組NO水平比QX組升高(P<0.05)；QX+QF組NO水平比QX組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表3。

表3各組細胞內皮功能變化比較(±s)

與ZC組比較，1)P<0.01；與QX組比較，2)P<0.05；3)P<0.01

3 討 論

“損傷反應”學說認為，血管內皮細胞損傷是冠心病心肌缺血發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。然而，目前對于CMECs缺血損傷的關注遠遠少于心肌細胞本身。

自噬作為細胞應對損傷的一種保護性反應，對維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定及生理功能有著非常重要的作用[6-9]。推測自噬可能是防止血管內皮缺血損傷的一種潛在機制，有可能成為心血管疾病治療的新靶點和新策略。Xie等[10]用AGEs修飾的牛血清白蛋白AGEs-BSA培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，發(fā)現(xiàn)AGEs-BSA 在作用早期可以提高 HUVECs 的自噬水平而抵抗損傷。Han等[11]發(fā)現(xiàn)預孵育姜黃素能誘導HUVECs自噬，顯著增加過氧化氫處理HUVECs的生存能力。張艷林等[12]用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激內皮細胞后發(fā)現(xiàn)ox-LDL可誘導細胞自噬，同時乳酸脫氫酶(LDH)和ET-1的分泌增加說明細胞受到損傷，而這種損傷可被自噬誘導劑雷帕霉素所降低，被自噬抑制劑3-MA所增強，提示自噬在ox-LDL導致的內皮細胞損傷中起保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血CMECs能夠發(fā)生自噬，但是細胞凋亡增加，內皮功能受到損傷，雷帕霉素干預后的缺血CMECs，電鏡下觀察到自噬小體數(shù)目增多，細胞凋亡減少，內皮功能得到改善，缺血CMECs的自噬流是受到抑制的，整個自噬過程是存在障礙的，這種障礙很有可能發(fā)生在自噬溶酶體的環(huán)節(jié)。

根據(jù)冠心病“本虛標實”的基本病機，結合戴國華教授提出的冠心病“風病”學說，認為心腎陽虛、氣血失調是冠心病發(fā)病的基礎，風邪是冠心病重要的致病因素，脈滯風阻是冠心病發(fā)作的關鍵病理環(huán)節(jié)。確立了祛風活血通絡、補腎益氣生脈的治療方法，研制成中藥祛風生脈顆粒，從風邪論治冠心病有著豐富的臨床經驗，且對安全性的顧慮較少。用祛風生脈顆粒大鼠含藥血清，與缺血CMECs共孵育，電鏡下觀察到自噬小體數(shù)目明顯增多，同時觀察到較多的自噬溶酶體，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高，細胞總凋亡率明顯減少，ET-1水平降低(P<0.01)，提示祛風生脈顆粒干預后不僅促進了自噬小體的生成，而且促進了整個自噬流，包括自噬溶酶體的生成，達到減少細胞凋亡，改善內皮功能的干預效應。至于祛風生脈顆粒調控自噬的分子機制，尚需要進一步深入研究。