張姝 靳曉娜 黨永紅 霍力 李方

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京市核醫(yī)學(xué)分子靶向診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 100730

Notch 信號(hào)通路是一種普遍存在于從果蠅到哺乳動(dòng)物等眾多生命體中具有高度保守性的關(guān)鍵信號(hào)通路，其功能是參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡、黏附及器官發(fā)育。Notch 信號(hào)通路是 由Notch 受 體、Notch 配 體 和CSL（CBF-1、suppressor of hairless、Lag 的 合 稱）-DNA 結(jié) 合 蛋白3 部分組成。Notch 受體和配體均在細(xì)胞膜上表達(dá)。Notch 受體胞外區(qū)是配體結(jié)合并激活Notch 受體的部位，Notch 受體胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain，NICD)為其活性成分，未成熟的Notch 受體與鄰近細(xì)胞配體結(jié)合后被激活，經(jīng)過3 次裂解產(chǎn)生活性成分NICD。而關(guān)鍵的裂解發(fā)生在S3 位點(diǎn)，即由γ 分泌酶介導(dǎo)的切割作用而產(chǎn)生NICD。當(dāng)NICD 進(jìn)入核內(nèi)后，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。近年來，許多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Notch 信號(hào)通路失調(diào)與包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)，在這些腫瘤中發(fā)現(xiàn)Notch 通路持續(xù)活化[1-5]。(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨?；?S-苯基甘氨酸叔丁酯（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT）是一種γ 分泌酶抑制劑，能夠通過阻斷Notch 信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲[6-7]。本研究以DAPT 為前體進(jìn)行體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，合成11C-N-甲基-DAPT(簡(jiǎn)稱11C-DAPT)，初步研究其在正常新西蘭兔體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布，為進(jìn)一步開展此類腫瘤特異性顯像劑的轉(zhuǎn)化研究及指導(dǎo)同類腫瘤分子靶向藥物的治療奠定基礎(chǔ)、提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2 由德國海德堡大學(xué)Freiss.H 教授惠贈(zèng)。DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS 均購自美國Hyclone 公司；DAPT購自美國Selleck 公司；二甲基亞砜購自美國Sigma/Aldrich 公司。NucleoCounter NC-100 型全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自丹麥chemometec 公司；Sep-Pak QMA SPE 分離柱購自美國Waters 公司。使用美國GE 公司的MINItrace Ⅱ回旋加速器、TRACERlab FXC Pro 合成模塊和Elite PET/CT。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)雄性新西蘭兔1 只，3月齡，體質(zhì)量3 kg，許可證編號(hào)：SYXK(京，2015-0025)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）法檢測(cè)DAPT和CH3-DAPT 對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響

人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2 培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液（加10%胎牛血清），在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代3 代以上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)傳代后的人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2 用0.25%胰酶進(jìn)行消化，用DMEM 培養(yǎng)液制成單個(gè)細(xì)胞懸液，用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個(gè)/mL，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔體積100 μL。在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，分別加入不同濃度梯度的DAPT（30、45、60、70、80、90、 120 μmol/L）和CH3-DAPT（10、20、40、80、120、160、200 μmol/L）溶液，二者均溶于DMEM 培養(yǎng)液。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和空白組，對(duì)照組加入相同體積的DMEM 培養(yǎng)液，空白組無細(xì)胞只加培養(yǎng)液。DAPT 和CH3-DAPT（實(shí)驗(yàn)組）均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。CCK-8 法測(cè)定每組各孔的光密度（optical density，OD）值。

使用SPSS19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)ogit 回歸分析，并計(jì)算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)

1.3.2 自動(dòng)化合成11C-DAPT

回旋加速器生產(chǎn)11C-CO2，在全自動(dòng)合成儀上經(jīng)H2還原得到11C-CH4，11C-CH4與I2反應(yīng)生成11C-CH3I 后轉(zhuǎn)入反應(yīng)瓶；2 mg 前體DAPT 溶于0.4 mL二甲基亞砜，預(yù)先置于反應(yīng)瓶中，加入7 μL 5 mol/L NaOH ，充分振蕩混勻。11C-CH3I 與DAPT 混合，標(biāo)記反應(yīng)80℃，反應(yīng)時(shí)間3 min，洗脫液終止反應(yīng)，降溫冷卻至35°C。產(chǎn)物使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀進(jìn)行分離純化（C18柱，洗脫液300 mL 30%乙醇，流速2.5 mL/min，紫外線254 nm），收集產(chǎn)物，生理鹽水稀釋，無菌濾膜過濾待用。11C-DAPT 的合成路線見圖1。

1.3.3 正常兔11C-DAPT PET/CT 顯像

新西蘭兔1 只，耳緣靜脈注射125.8 MBq（3.4 mCi）11C-DAPT 后用PET/CT 進(jìn)行動(dòng)態(tài)掃描，0、7、14、21、28 min 各 采 集1 次，共5 次。CT 掃描參數(shù)：電壓120 kV，電流150 mA，層厚5 mm；PET 掃描參數(shù)：1 min/床位，共4 個(gè)床位。掃描結(jié)束后，對(duì)原始圖像采用OSEM 圖像重建技術(shù)進(jìn)行重建。獲得CT、PET 及二者融合圖像。在主要臟器勾畫ROI，測(cè)量放射性濃度（kBq/mL）及其隨時(shí)間的變化。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DAPT 和CH3-DAPT 對(duì)胰腺癌細(xì)胞

MIAPaCa-2 增殖的影響

CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果顯示，DAPT 和CH3-DAPT對(duì)胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2 增殖的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。DAPT 和CH3-DAPT 作用于胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2 后72 h，細(xì)胞增殖的IC50分別為64.2 μmol/L 和180.0 μmol/L。

2.2 11C-DAPT 的鑒定結(jié)果

11C-DAPT 整個(gè)合成過程大約30 min，放射化學(xué)產(chǎn)率25%～35%（未校正，3 次重復(fù)試驗(yàn)），放射化學(xué)純度＞95%。HPLC 檢測(cè)11C-DAPT 與12C-DAPT標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致，大約在5.3 min 時(shí)（圖2、3）。

2.3 11C-DAPT 在正常兔體內(nèi)的分布

兔注射11C-DAPT 后，體內(nèi)吸收迅速，以腎臟分布較多，肝臟、腸道、肺、腦等臟器攝取較低。7 min 時(shí)肝臟、腎臟攝取達(dá)到高峰，28 min 后降低＞50%（表1）。注射后即刻掃描，腸道、腦及肺的放射性攝取達(dá)到高峰，隨時(shí)間延長逐漸降低。0～21 min，隨時(shí)間延長，膀胱的放射性攝取逐漸增高。兔喉部前方可見放射性攝取增高組織，且隨時(shí)間延長攝取逐漸降低，但受PET/CT 分辨率的影響，無法明確具體器官來源。圖4和圖5顯示注射11C-DAPT 后正常兔的PET/CT 圖像。

3 討論

近年來有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與持續(xù)活化Notch 信號(hào)通路相關(guān)[8]。另外，Notch 信號(hào)通路能夠促進(jìn)癌癥干細(xì)胞的形成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，通過藥物性阻斷該通道能夠抑制腫瘤的生長、克服化療藥物耐藥性[9-11]。Notch 信號(hào)通路藥物性阻斷劑包括單克隆抗體、γ 分泌酶抑制劑、小分子干擾RNA和天然化合物。其中γ 分泌酶抑制劑靶向藥為目前最被廣泛及深入研究的Notch 信號(hào)通路藥物性阻斷劑，包括RO4929097、MK-0752 和DAPT等[11-12]。

圖1 11C-(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）的合成路線圖 Fig.1 Radiosynthetic route of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)

胰腺癌為消化系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤，5年生存率低于5%[13]。胰腺癌對(duì)放化療不敏感，目前手術(shù)是治療胰腺癌最有效手段，大約60%的胰腺癌患者在確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，25%為局部晚期患者，且不能進(jìn)行根治切除術(shù)[14]。因此，尋找和建立早發(fā)現(xiàn)、早診斷的方法，開發(fā)靶向治療藥物，成為提高胰腺癌診療效果的主攻方向之一。臨床前研究結(jié)果證實(shí)，DAPT 能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的生長、促進(jìn)凋亡，與化療藥物聯(lián)合使用可以提高化療效果[6-7,15]。本研究觀察了不同濃度的DAPT 對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系MiaPaca-2 增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAPT 對(duì)該細(xì)胞株增殖的抑制作用呈劑量依賴性關(guān)系，與杜瀟等[6]研究結(jié)果一致；同時(shí)使用CH3-DAPT 作 用 于MiaPaca-2 細(xì)胞，結(jié)果表明其對(duì)該細(xì)胞株的增殖亦有抑制作用。雖然CH3-DAPT 的抑制作用弱于DAPT，但說明CH3-DAPT 未改變DAPT 的生物學(xué)特性，仍可作用于胰腺癌細(xì)胞，發(fā)揮抑制增殖作用，為11C-DAPT 作為分子探針進(jìn)行胰腺癌的顯像提供了理論依據(jù)。

圖2 12C-DAPT 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 保留時(shí)間圖 圖中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨?；?S-苯基甘氨酸叔丁酯；HPLC：高效液相色譜。 Fig.2 Retention time of reference substance 12C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) in analytic HPLC

圖3 11C-DAPT HPLC 純化后的保留時(shí)間圖 圖中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨?；?S-苯基甘氨酸叔丁酯；HPLC：高效液相色譜。 Fig.3 Retention time of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine tbutyl ester(DAPT) purified by preparative HPLC

表1 11C-DAPT 在正常新西蘭兔體內(nèi)的生物學(xué)分布（ ±s，n=1）Table 1 Biodistribution of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) in normal New Zealand rabbit

表1 11C-DAPT 在正常新西蘭兔體內(nèi)的生物學(xué)分布（ ±s，n=1）Table 1 Biodistribution of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) in normal New Zealand rabbit

注：表中，DAPT：(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯；ROI：感興趣區(qū)。

組織 ROI 的放射性濃度 (kBq/mL)0 min 7 min 14 min 21 min 28 min腦 38.3±1.53 26.6±0.58 23.3±0.58 16.0±1.00 14.0±0.00肺 40.6±2.52 28.3±2.08 20.0±2.64 12.6±1.52 12.3±0.58肝臟 57.0±1.73 66.7±0.58 50.3±0.58 45.3±1.57 30.0±1.00腸道 43.3±3.51 35.0±3.00 27.3±1.53 21.3±1.53 16.7±0.58腎臟 83.7±3.06 123.6±5.69 75.3±2.31 65.0±2.65 51.6±3.06膀胱 2.3±0.58 3.3±1.15 29.7±0.58 60.0±0.00 49.7±0.58

11C 標(biāo)記的分子探針通常是將11C-CH3標(biāo)記到有機(jī)化合物中，是PET 放射性藥物合成的重要手段之一。本研究使用11C 標(biāo)記DAPT，不會(huì)引起原生物分子化學(xué)性質(zhì)的變化，而且方法靈活、過程簡(jiǎn)單。查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，未見關(guān)于Notch 信號(hào)通路抑制劑分子探針的報(bào)道，考慮到DAPT 具有3 個(gè)甲基化取代位點(diǎn)，更容易被標(biāo)記，所以選擇以DAPT 作為前體，整個(gè)合成過程由合成器自動(dòng)完成，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)、分析，發(fā)現(xiàn)將淋洗液乙醇濃度調(diào)整為30%時(shí)，合成效率為25%～30%，放射化學(xué)純度大于95%。整個(gè)合成過程簡(jiǎn)單、快速，放射化學(xué)純度高。本研究的分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射11C-DAPT后藥物快速分布于各臟器，在腎臟攝取最多，肝臟攝取較少，腸道、腦和肺攝取低。在7 min 時(shí)肝臟和腎臟放射性濃聚達(dá)到高峰，28 min 時(shí)降低＞50%。而膀胱內(nèi)放射性攝取隨時(shí)間的增加逐漸增多，這說明11C-DAPT 主要通過腎臟排泄，在體內(nèi)清除快。胰腺和脾臟因體積較小，且與鄰近腸道組織難以區(qū)分，勾畫ROI 較困難，未測(cè)量放射性濃度。但是從圖像觀察，除了腎臟，腹腔內(nèi)其他臟器放射性攝取較低，具有較低的本底，為進(jìn)行胰腺病變的研究奠定了基礎(chǔ)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)喉部前方軟組織內(nèi)可見較高的放射性攝取，隨時(shí)間延長逐漸降低，通過PET/CT 大體的定位，考慮為頜下腺的可能性大，并且文獻(xiàn)報(bào)道Notch 信號(hào)通路調(diào)節(jié)唾液腺的發(fā)育以及再生，Notch1～4 受體在唾液腺細(xì)胞表面均有表達(dá)[16-17]。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將用小鼠做離體測(cè)量，通過測(cè)量各器官（包括胰腺、脾臟、頜下腺等）的放射性計(jì)數(shù)，進(jìn)一步明確11C-DAPT 的生物學(xué)分布。

綜上，本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，DAPT 甲基化未改變DAPT的生物學(xué)特性，仍能夠作用于胰腺癌細(xì)胞，抑制其增殖，在此基礎(chǔ)上本研究成功制備了基于Notch 信號(hào)通路抑制劑的分子探針11C-DAPT，合成過程簡(jiǎn)便、快速，放射化學(xué)純度高，生物學(xué)分布提示11C-DAPT 在肝臟、腸道的攝取低，為11C-DAPT 進(jìn)行胰腺癌的顯像奠定了基礎(chǔ)。我們下一步將建立胰腺癌皮下移植瘤動(dòng)物模型，觀察胰腺癌對(duì)11C-DAPT 的攝取情況，進(jìn)一步探索11C-DAPT 作為胰腺癌新型靶向分子探針的可能性。

圖4 新西蘭兔注射11C-DAPT 后不同時(shí)間的PET 冠狀位圖像 圖中，A：0 min；B：7 min；C：14 min；D：21 min；E：28 min。DAPT：(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨?；?S-苯基甘氨酸叔丁酯。 Fig.4 Coronal PET images of New Zealand rabbit at different time point after injection of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)

圖5 新西蘭兔注射11C-DAPT 14 min 后的PET/CT 冠狀位圖像 圖中，DAPT：(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨?；?S-苯基甘氨酸叔丁酯。 Fig.5 Coronal PET,CT and fusion images of New Zealand rabbit at 14 min after injection of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester