王 飛， 許 青

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海 200032

光動(dòng)力療法是目前臨床上較新的腫瘤治療方法，對(duì)皮膚癌具有較好的療效，但對(duì)實(shí)體腫瘤效果一般，主要原因?yàn)槎鄶?shù)光敏劑存在對(duì)腫瘤靶體選擇性低、能量利用率低、易受實(shí)體腫瘤乏氧環(huán)境影響且患者治療后易受陽(yáng)光傷害等缺點(diǎn)[1-2]。核黃素(riboflavin，RF)是構(gòu)成生物氧化過(guò)程中所必須的黃素核苷酸(FMN)、黃素腺嘌啉二核苷酸(FAD)的主要活性基團(tuán)，以自由態(tài)或共軛態(tài)廣泛存在于人體各器官和各類(lèi)水果中，對(duì)促進(jìn)代謝、維持皮膚和視覺(jué)的正常功能具有一定作用[3]。核黃素作為一種內(nèi)源性光敏劑，具有較高的系間竄越系數(shù)，易從短壽命的單重激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)壽命的三重激發(fā)態(tài)，且量子產(chǎn)額較高，從而能誘發(fā)一系列的光化學(xué)和光生物學(xué)反應(yīng)[4]。

一系列研究[5-7]表明，在可見(jiàn)光和紫外線(UVA)照射下，核黃素可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)[8]認(rèn)為，核黃素是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞損傷較為重要的內(nèi)源性光敏劑之一，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究采用噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT)法及熒光顯微鏡觀察核黃素體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞的光敏損傷作用，并初步探討其可能的作用位點(diǎn)，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 細(xì)胞培養(yǎng)基RPMΙ-1640、胰蛋白酶、小牛血清、雙抗均為Gibco公司產(chǎn)品；MTT、二甲亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司；PBS緩沖液購(gòu)自鼎國(guó)生物。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、96孔板、6孔板均為Greiner產(chǎn)品。酶標(biāo)儀為Rayto產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自一恒科技有限公司；潔凈工作臺(tái)為蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；臺(tái)式紫外燈購(gòu)自鞏義予華儀器有限公司；熒光顯微鏡為ZEISS公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及計(jì)數(shù) 宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，經(jīng)PBS緩沖液洗滌2次，而后用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。吸取50 μL細(xì)胞懸液滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，穩(wěn)定后計(jì)數(shù)4個(gè)角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mL)=4大格細(xì)胞數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×104。

1.3 MTT法測(cè)定正常及光敏狀態(tài)下核黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞存活率的影響

1.3.1 正常狀態(tài)下核黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞存活率的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌細(xì)胞，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度約1×104個(gè)/mL)，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積100 μL，6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)照組加入培養(yǎng)基、給藥組加入不同濃度的核黃素，置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)48 h。每孔中加入10 μL MTT溶液于相同條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度值(D值)，選用490～630 nm雙波長(zhǎng)系統(tǒng)，重復(fù)3次，計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組D值÷對(duì)照組D值)/%。

1.3.2 光敏狀態(tài)下核黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞存活率的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌細(xì)胞配成細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度約1×104個(gè)/mL)，接種于96孔板，6復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜。每孔中加入10、50、100、150、200、250 μmol/L終濃度的核黃素，置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h。然后，光照組用24W紫外燈(中心波長(zhǎng)365 nm)照射45 min，光照后采用培養(yǎng)基潤(rùn)洗2次，每孔中加入正常培養(yǎng)基100 μL、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)2 h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.4 熒光顯微鏡檢測(cè)核黃素在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于20 mm×20 mm蓋玻片，置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h。用不同終濃度的核黃素溶液作用24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗3次，熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm)下觀察其亞細(xì)胞定位、拍照。

1.5 不同作用條件下核黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞形態(tài)的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于20 mm×20 mm蓋玻片，置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。加入無(wú)血清培養(yǎng)基配制的100 μmol/L的核黃素，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，光照組予以光照，光源中心波長(zhǎng)365 nm，光照時(shí)間45 min。培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，加入正常培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。取出蓋玻片，PBS沖洗3次，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2 結(jié) 果

2.1 無(wú)光照條件下核黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果(圖1)表明：無(wú)光照條件下，與正常培養(yǎng)細(xì)胞相比，10、50、100、150、200、250 μmol/L核黃素孵育48 h后，宮頸癌細(xì)胞存活率無(wú)明顯改變，未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，且核黃素在較低濃度范圍內(nèi)(10、50、150 μmol/L)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用。

2.2 光敏狀態(tài)下核黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果(圖1)表明：光照45 min，不同濃度的核黃素孵育24 h后，宮頸癌細(xì)胞存活率明顯降低，且宮頸癌細(xì)胞存活率隨核黃素濃度的增加而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 核黃素在宮頸癌細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位 結(jié)果(圖2)表明：當(dāng)濃度較低(25 μmol/L)時(shí)，核黃素主要集中在核膜上和細(xì)胞核內(nèi)部，提示光敏損傷的主要位點(diǎn)是細(xì)胞核；當(dāng)濃度較高(200 μmol/L)時(shí)，細(xì)胞膜上也有核黃素的分布。

圖1 MTT法測(cè)定核黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞存活率的影響

圖2 光敏條件下核黃素作用24 h后在宮頸癌細(xì)胞中的定位

A: 核黃素25 μmol/L；B: 核黃素200 μmol/L. Original magnification: ×400

2.4 光學(xué)顯微鏡觀察不同條件下核黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞形態(tài)的影響 結(jié)果(圖3)表明：?jiǎn)为?dú)核黃素和單獨(dú)光照作用下，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯；核黃素+光照作用下，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，同時(shí)從培養(yǎng)瓶壁大量脫落。

圖3 不同條件下核黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞形態(tài)的影響

A:正常培養(yǎng)；B:單獨(dú)365 nm紫外光照射；C:單獨(dú)100 μmol/L核黃素；D: 100 μmol/L核黃素, 光照波長(zhǎng)365 nm，光照時(shí)間45 min. Original magnification: ×200

3 討 論

盡管目前光動(dòng)力治療腫瘤的研究已經(jīng)取得一定成果，一系列光敏劑(血卟啉類(lèi)混合物、紅紫素、海棠素、紫菜堿等)已在臨床得到應(yīng)用，但該方法仍有很多局限[9-10]。多數(shù)光敏劑存在對(duì)腫瘤靶體選擇性低、能量利用率低、易受實(shí)體腫瘤內(nèi)乏氧環(huán)境的影響，且患者治療后易受陽(yáng)光傷害等缺點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，光照條件下，核黃素孵育48 h后，宮頸癌細(xì)胞存活率明顯降低，且隨核黃素濃度的增加而降低，提示作為內(nèi)源性光敏劑的核黃素可能在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝。為了從根本上克服光動(dòng)力療法的弱點(diǎn)，有必要開(kāi)拓有別于傳統(tǒng)光動(dòng)力療法的新型光敏氧化療法，即按照Ⅰ型反應(yīng)機(jī)制選擇氧化性強(qiáng)、能量利用率高、選擇性好、治療后患者不易受陽(yáng)光傷害且不受乏氧環(huán)境影響的光敏劑。

熒光顯微鏡是生物學(xué)常用儀器，可以觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白、DNA及其他生物大分子的位置、結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。由于核黃素作為一種光敏劑，可被激發(fā)產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，利用這一特性，可以觀察其在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，并以此作為對(duì)光敏氧化作用機(jī)制進(jìn)行準(zhǔn)確判斷的依據(jù)。亞細(xì)胞定位決定了光敏劑在細(xì)胞中發(fā)生作用的位置，不同的光敏劑對(duì)生物組織的損傷機(jī)制因其作用位點(diǎn)差異而不同[11-12]。本研究表明，核黃素在宮頸癌細(xì)胞內(nèi)的分布因其濃度不同而有所差異，其中細(xì)胞核及細(xì)胞膜均可能是其光敏化細(xì)胞的作用位點(diǎn)，提示核黃素光敏損傷細(xì)胞基于一種綜合的光敏氧化損傷機(jī)制。此外，光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，核黃素光敏損傷細(xì)胞形態(tài)的變化與其細(xì)胞存活率相似，即無(wú)光照時(shí)，核黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)可能有促進(jìn)作用，但在365 nm光照條件下對(duì)宮頸癌細(xì)胞有明顯的殺傷效果。

綜上所述，作為一種內(nèi)源性光敏劑，核黃素自身對(duì)宮頸癌細(xì)胞無(wú)毒性，但在光敏狀態(tài)下無(wú)需氧參與即能損傷細(xì)胞。本研究結(jié)果提示，核黃素有望成為應(yīng)用于臨床治療宮頸癌的潛在光敏藥物。