楊 彬， 劉 川， 張 大 偉， 張 春 枝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所， 天津 300308 )

0 引 言

核黃素，又名維生素B2，是一種人體必需的維生素[1]。核黃素應(yīng)用廣泛，可以用作食品添加劑，飼料添加劑以及制作藥品，具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。核黃素的生產(chǎn)方法有3種，分別為化學(xué)合成法、半化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法[3]。由于生物發(fā)酵法生產(chǎn)核黃素產(chǎn)量高且成本低，目前已成為核黃素大規(guī)模生產(chǎn)的方法[4]。用于核黃素生產(chǎn)的菌株有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、阿舒假囊酵母(Eremotheciumashbyii)以及曾經(jīng)用于生產(chǎn)的酵母念珠菌(C.famata)[5-7]?？莶菅挎邨U菌作為一種安全高效的模式菌株是核黃素生產(chǎn)的主流菌株。

核黃素的代謝通路可以分為3個(gè)部分[8]：磷酸戊糖途徑合成核黃素前體物質(zhì)核酮糖-5-磷酸(Ru5P)，嘌呤代謝途徑合成黃素的另一前體物質(zhì)鳥苷三磷酸(GTP)，核黃素合成途徑利用Ru5P與GTP合成核黃素[9]。核黃素的代謝通路已經(jīng)研究清楚，通過分析高產(chǎn)菌株的核黃素代謝通路變化，可以為從頭構(gòu)建一株高產(chǎn)核黃素菌株提供思路。

本研究通過發(fā)酵測(cè)定一株高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌SYL-1高產(chǎn)菌株的核黃素產(chǎn)量，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)分析其核黃素代謝通路基因表達(dá)量變化，探明這一高產(chǎn)核黃素菌株的核黃素代謝通路的變化，以期為枯草芽孢桿菌高產(chǎn)核黃素提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和改造思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌種：高產(chǎn)核黃素菌株SYL-1，具有紅霉素抗性基因，實(shí)驗(yàn)室保藏；低產(chǎn)核黃素菌株LY-05，實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

試劑：細(xì)菌總RNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，賽默飛世爾科技公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；DNA聚合酶，膠回收試劑盒，Omega Bio-tek公司。

1.2 儀 器

ABI 7500 Fast快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；AR124CN精密天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；V-1600型可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Centrifuge 5418小型臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 發(fā)酵方案

使用LB培養(yǎng)基進(jìn)行菌株活化，利用玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。采用500 mL搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)，添加培養(yǎng)基80 mL。培養(yǎng)條件：37 ℃、180 r/min，調(diào)整發(fā)酵初始OD600為0.1，發(fā)酵中不補(bǔ)料。培養(yǎng)基組分：2%玉米漿干粉，4%蔗糖，0.05%硫酸鎂，1%硫酸銨，1.5%酵母抽提物，0.3%磷酸氫二鉀，0.1%磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH至7.1。

1.3.2 核黃素產(chǎn)量測(cè)定

核黃素產(chǎn)量(g/L)測(cè)定根據(jù)發(fā)酵液經(jīng)堿處理后在444 nm處吸光度計(jì)算。

ρ=A444/0.032 1

1.3.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用細(xì)菌總RNA提取試劑盒進(jìn)行菌株RNA提取，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄操作，使用試劑盒中提供的隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。

1.3.4 RT-PCR方法

采用NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus酶和ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR，采用7500 Software V2.0.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)使用的內(nèi)參基因?yàn)锳TP合成酶基因atpA以及RNA聚合酶亞基基因rpoA。在反應(yīng)體系中加入ROXII平衡各樣品之間的熒光值，反應(yīng)體系為20 μL，每個(gè)基因重復(fù)5次，引物見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需引物Tab.1 Primes of RT-PCR

1.3.5 質(zhì)粒構(gòu)建

使用PrimeSTAR?Mix DNA Polymerase進(jìn)行質(zhì)粒和目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，膠回收試劑盒進(jìn)行片段回收，使用ClonExpress?Ⅱ連接試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒與目的基因的組裝，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序工作由金唯智公司完成。組裝好的質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α菌株中進(jìn)行保存和復(fù)制，使用細(xì)菌質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行提取。

1.3.6 過表達(dá)菌株構(gòu)建

采用spizzen轉(zhuǎn)化的方式在LY-05菌株中導(dǎo)入過表達(dá)質(zhì)粒，采用含有壯觀霉素抗性的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，構(gòu)建的菌株及其攜帶質(zhì)粒的基本信息如表2所示。

表2 LY-05中構(gòu)建的過表達(dá)菌株基本信息Tab.2 Basic information of overexpression strainconstructed in LY-05

2 結(jié)果與討論

2.1 核黃素生產(chǎn)能力檢測(cè)

搖瓶發(fā)酵測(cè)定SYL-1與LY-05發(fā)酵48 h的核黃素產(chǎn)量。SYL-1菌株的核黃素產(chǎn)量在發(fā)酵48 h達(dá)到1.90 g/L(±0.02 g/L)，對(duì)照菌株LY-05核黃素產(chǎn)量為320.52 mg/L(±10 mg/L)，SYL-1核黃素產(chǎn)量比LY-05高4.9倍。表明SYL-1的核黃素代謝通路較LY-05有明顯不同，在細(xì)胞中有更多的物質(zhì)流向核黃素代謝通路。

2.2 代謝通路基因表達(dá)量變化

為了探究SYL-1菌株核黃素代謝通路上基因表達(dá)量的變化，對(duì)其基因gmk、gntZ、prs、purE、yqeC、yqjI、zwf表達(dá)量進(jìn)行分析，如圖1所示。將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并利用cDNA進(jìn)行RT-PCR分析。從圖1可以看出，在SYL-1菌株中基因gmk、gntZ、prs、purE、yqeC、yqjI、zwf表達(dá)量相較于LY-05有提高，可能通過過表達(dá)這些基因或相關(guān)基因提高LY-05核黃素產(chǎn)量。

2.3 過表達(dá)發(fā)酵

在LY-05中使用質(zhì)粒過表達(dá)基因prs、gntZ、zwf以及核黃素操縱子基因ribA發(fā)酵結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，過表達(dá)基因prs、gntZ、zwf均可以提高LY-05的核黃素產(chǎn)量，其中過表達(dá)基因ribA核黃素產(chǎn)量最高，在發(fā)酵48 h達(dá)到469.23 mg/L。證明在LY-05中過表達(dá)prs、gntZ、zwf基因可以提高核黃素產(chǎn)量。

圖1 SYL-1菌株相較于LY-05基因表達(dá)量的變化Fig.1 Changes in gene expression of SYL-1 comparedwith LY-05

圖2 質(zhì)粒過表達(dá)基因核黃素產(chǎn)量Fig.2 Riboflavin production of strain with plasmidoverexpression gene

2.4 代謝通路變化與核黃素產(chǎn)量

對(duì)核黃素代謝通路上的基因進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，以探索核黃素代謝通路在基因水平上的變化，結(jié)果如圖3所示。yfkN、prs、tkt以及ywlF基因的表達(dá)量提高，證明rpe基因突變會(huì)使核黃素代謝通路上的基因表達(dá)量發(fā)生變化，從而使SYL-1改造菌株的核黃素產(chǎn)量提高。在實(shí)驗(yàn)室保藏的構(gòu)建菌株LY-05中使用pHP13質(zhì)粒過表達(dá)核黃素代謝通路上的基因prs、gntZ、zwf，核黃素產(chǎn)量均有提高，表明在LY-05中提高核黃素代謝通路流量可以提高核黃素產(chǎn)量。

3 結(jié) 論

采用搖瓶發(fā)酵法測(cè)定SYL-1菌株核黃素產(chǎn)量，通過RT-PCR分析其核黃素代謝通路上基因表達(dá)量。對(duì)比SYL-1與LY-05核黃素代謝通路基因表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)磷酸戊糖途徑和嘌呤代謝途徑基因表達(dá)量提高，SYL-1中核黃素代謝通路流量增加。通過在LY-05中過表達(dá)基因prs、gntZ、zwf提高了核黃素產(chǎn)量。

圖3 與LY-01相比基因yfkN、prs、tkt、ywlF表達(dá)量的變化Fig.3 Changes of gene yfkN, prs, tkt, ywlFexpression compared with LY-01

通過分析高產(chǎn)核黃素菌株的核黃素代謝通路上基因表達(dá)量的變化，可以找到有利于代謝改造的基因位點(diǎn)，通過在構(gòu)建菌種中導(dǎo)入這些位點(diǎn)，可以提高核黃素的產(chǎn)量，為以后核黃素高產(chǎn)菌株構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。