劉 梅，原居林，倪 蒙，張雷鳴，顧志敏,

(1.農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，上海 201306)

近年來，淡水養(yǎng)殖池塘重金屬超標(biāo)問題相關(guān)報道研究越來越多[1-4]，重金屬污染問題由于具有持久性、生物富集和放大作用已成為我國最重要的環(huán)境和食品安全問題之一[5-7]。Cu作為魚類生長必需元素之一，在水產(chǎn)飼料中過度添加的現(xiàn)象非常普遍，而殘餌在池塘底部堆積，造成其在表層沉積物中的含量不斷升高[8-9]；另外養(yǎng)殖過程中漁藥(如硫酸銅等)的濫用，進(jìn)一步導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中重金屬Cu含量不斷增加。由于重金屬極易吸附在水體的懸浮顆粒物中，且不能降解，因此通過各種途徑進(jìn)入養(yǎng)殖水體的重金屬最終通過吸附、沉降、埋藏等過程進(jìn)入到底泥中。重金屬在底泥中的大量積累會形成巨大的潛在危害和風(fēng)險[2,10]。許多研究顯示，我國淡水池塘底泥重金屬Cu含量遠(yuǎn)高于我國土壤環(huán)境質(zhì)量Ⅰ級標(biāo)準(zhǔn)(35 mg/kg)幾倍甚至幾十倍，如賈成霞等[1]調(diào)查發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)養(yǎng)殖塘底泥Cu含量為18～155 mg/kg，而施沁璇等[3]2014年調(diào)查發(fā)現(xiàn)湖州市養(yǎng)殖塘底泥Cu含量為10.50～98.20 mg/kg，因此池塘底泥重金屬Cu超標(biāo)問題不容忽視。

目前對土壤重金屬污染的治理研究大多以植物修復(fù)為主，通過植物對重金屬的吸收、累積、轉(zhuǎn)移來達(dá)到治理目的[11-12]。沉水植物因全株都生活在水體中，莖、葉的表皮都與根一樣具有吸收作用，這種結(jié)構(gòu)對重金屬元素的濃縮富集都有很強的作用。而且植物生長過程中需要少量的Cu，Cu是其正常生命活動所必需的微量元素之一，是一些酶(如多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶)的組成成分，可以影響氧化還原過程，還存在于葉綠體的質(zhì)體藍(lán)素中，參與光合作用的電子傳遞體系[13]，對植物的生長發(fā)育起著十分重要的作用。另外，養(yǎng)殖塘中種植沉水植物能夠改善水質(zhì)、抑藻控藻、提高池塘生態(tài)多樣性以及增強養(yǎng)殖水環(huán)境穩(wěn)定性，所以用沉水植物來修復(fù)養(yǎng)殖塘底泥重金屬Cu污染能夠帶來較高的生態(tài)經(jīng)濟效益[12,14]。

苦草(Vallisnerianatans)、輪葉黑藻(Hydrillaverticillata)和伊樂藻(Elodeanuttallii)是我國淡水養(yǎng)殖塘常見的多年生沉水草本植物，生物量大且生命力強，但是過量的Cu同樣會對這些植物生長造成不良影響，會使植物生長發(fā)育受阻、生理代謝過程發(fā)生絮亂等危害[15-17]。因此，本研究選擇這三種沉水植物作為試驗材料，通過綜合分析其對底泥重金屬Cu的富集效果及相關(guān)機理，篩選最佳修復(fù)淡水養(yǎng)殖塘底泥重金屬Cu污染的沉水植物，利用底泥-植物系統(tǒng)的吸附、轉(zhuǎn)化及自我調(diào)控功能，定期收獲地上部分并達(dá)到一定程度上對底泥Cu污染的修復(fù)，為今后深入修復(fù)重金屬Cu污染底泥提供一定的研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試底泥

供試底泥采自湖州市菱湖鎮(zhèn)加州鱸魚養(yǎng)殖塘，自然風(fēng)干后，先初步剔除其中粗雜質(zhì)，過100目篩，測得Cu的背景值為28.34 mg/kg，pH為7.2左右。用分析純的Cu(NO3)2溶液，拌入一部分風(fēng)干的原始底泥中并充分混勻，靜置鈍化兩周風(fēng)干后作為試驗底泥，測得配制后底泥中Cu含量為112.42 mg/kg，Cu污染程度為土壤環(huán)境質(zhì)量Ⅲ級標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到JENSEN底泥污染評價重污染級別。

1.2 供試植物

供試沉水植物苦草、輪葉黑藻和伊樂藻均采自浙江省湖州市養(yǎng)殖池塘。選取高度為15 cm左右、生長狀態(tài)良好、個體均勻帶根的植株作為試驗材料，移栽到無污染底泥的生態(tài)缸中，在1/10霍格蘭營養(yǎng)液水培適應(yīng)3 d后用于盆栽Cu污染修復(fù)試驗。

1.3 實驗設(shè)計

本試驗共設(shè)3個處理組，3個空白對照組，每個處理組和對照組各設(shè)3個重復(fù)。其中，HV：輪葉黑藻空白對照組，HV+Cu：輪葉黑藻Cu處理組，EN：伊樂藻空白對照組，EN+Cu：伊樂藻Cu處理組，VN：苦草空白對照組，VN+Cu：苦草Cu處理組。試驗采用透明的玻璃生態(tài)缸(長30 cm×寬20 cm×高50 cm)靜態(tài)模擬自然狀況下小型水體，將其置于通風(fēng)良好的室內(nèi)，其上30 cm處懸掛仿太陽燈，其光照度6 000 lx，光照時間為每天8∶00～20∶00。將原始底泥和配制好的底泥分別鋪入18個生態(tài)缸內(nèi)，厚度約15 cm。然后每個生態(tài)缸中加入25 L曝曬的自來水，生態(tài)缸內(nèi)水深約40 cm，然后將初始鮮重200 g的三種沉水植物分別植入盛有空白對照組和Cu處理組底泥的生態(tài)缸中，經(jīng)測定實驗初期水體中總氮平均濃度為1.2 mg/L,硝態(tài)氮為 0.71 mg/L，全磷為0.16 mg/L，其中Cu處理組水體中銅離子濃度為0.82 mg/L。培養(yǎng)試驗從2017年8月2號開始至11月29號結(jié)束，整個試驗周期為120 d，三種沉水植物基本完成一個生長周期，同時為了保證植物正常生長營養(yǎng)元素的需要，每14 d加入100 mL霍格蘭營養(yǎng)液(銅離子濃度為0.025 mg/L)。每30 d收割一次植物地上樣品(分為莖部和葉部)及植物根際土樣，最后一次收集整株植物并分別取根莖葉三個部位。試驗中蒸發(fā)的水分定期用曝曬的自來水補充。

1.4 樣品處理

Cu含量的測定：取植物樣先用自來水充分沖洗，再用0.1 mol/L的HCl洗凈，最后用去離子水淋洗2～3次，吸干表面水分，將植物樣品分為根部、莖部和葉部三部分，置于烘箱中105 ℃殺青30 min，70 ℃下烘干至恒重，稱取各部位干重，研磨過60目尼龍篩待測；將土樣自然風(fēng)干后，研磨過100目尼龍篩待測。用HNO3-HClO4消解植物樣，HCl-HNO3-HClO4消解土樣。用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法進(jìn)行Cu含量的測定。

SOD和POD酶活的測定：取植株相同部位的鮮葉片，用蒸餾水洗凈、揩干，用于測定各項生理指標(biāo)。SOD、POD酶液制備時取材于預(yù)冷研缽中，加入pH 7.8磷酸緩沖液(0.05 mol/L)，冰浴下研磨成勻漿，10 000 r/min低溫(4 ℃)離心20 min，上清液即為所需要的酶液。SOD和POD酶活測定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒及美國伯騰儀器有限公司的Microplate Reader Gen5測定。

土壤脫氫酶活性采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定[18]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

(1)生長率：

GR=dw/dt

式中：GR為生長率；w為植物增加的生物量；t為植物生長的時間。

(2)去除率：

R=(C0-C)/C0×100%

式中：R為去除率；C0為試驗開始時底泥中重金屬含量；C為試驗結(jié)束時底泥中重金屬含量。

用Excel 2013、SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。圖由Excel 2013繪制，表由Excel 2013生成，使用SPSS 18.0軟件中的獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異比較，描述性統(tǒng)計使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬銅對三種沉水植物生長特征的影響

表1顯示，與移植時相比，試驗結(jié)束時三種沉水植物收獲的生物量均有明顯增加，這表明濃度為112.42 mg/kg的Cu脅迫對三種沉水植物的生長并沒有造成嚴(yán)重的影響。輪葉黑藻和伊樂藻在整個生長期間，Cu處理組收獲總鮮重顯著低于對照組，而苦草總鮮重雖然低于對照組，但差異不顯著，說明苦草對Cu脅迫表現(xiàn)出較強的耐受性。

輪葉黑藻在前3次收割時，Cu處理組的莖部和葉部鮮重均顯著低于不加Cu對照組，而在第四次收割時處理組之間均差異不顯著；伊樂藻在前兩次收割時，Cu處理組莖部鮮重低于對照組，但差異不顯著，而葉部鮮重顯著低于對照組，在第三、四次收割時，除第四次收割的根部鮮重顯著低于對照組外，其他均差異不顯著；苦草在第一次和第四次收割時，處理組間葉部鮮重存在顯著差異，且最后一次收獲的處理組根部鮮重顯著低于對照組，其他均是Cu處理組根部和葉部低于對照組，但差異不顯著。說明Cu脅迫條件下，沉水植物盡管能正常生長，但其根莖葉生長受到不同程度的影響，具體影響程度因品種、收獲時間不同而存在一定差異。

表1 三種沉水植物根莖葉收獲鮮重變化特征

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同行不同小寫字母表示不同處理之間在0.05水平存在顯著差異(n=3)，下同。

2.2 三種沉水植物不同部位對重金屬銅的累積差異

從表2可以看出Cu處理組和對照組中每種沉水植物收獲時根部含Cu量均顯著大于葉部，而葉部含Cu量顯著大于莖部。值得注意的是整個實驗期間，大部分莖和葉被定期收割三次，根部則未被收割，而最終根部Cu含量只是莖葉含量的1.20～1.64倍，說明根部對Cu吸收富集作用存在一定閾值。通過比較各對照組之間三種沉水植物根莖葉Cu含量發(fā)現(xiàn)，其大致順序依次為輪葉黑藻>苦草>伊樂藻，而Cu處理組中其大致順序依次為苦草>輪葉黑藻>伊樂藻。結(jié)果表明苦草較其他兩種沉水植物對Cu具有更強的耐受能力，可以作為受Cu污染養(yǎng)殖塘底泥植物修復(fù)的先鋒植物，而輪葉黑藻可以作為未受Cu污染養(yǎng)殖塘底泥進(jìn)一步生物凈化的植物品種。

表2 三種沉水植物收貨時根莖葉Cu含量變化特征

植物對重金屬的吸收分布情況是耐性物種選擇的重要指標(biāo)之一，根據(jù)沉水植物不同部位含銅量和生物量計算了三種沉水植物的Cu累積量。從圖2可以看出，各對照組之間，Cu累積量順序依次為輪葉黑藻>苦草>伊樂藻，但無顯著性差異；而對于Cu處理組，Cu累積量順序依次為苦草>輪葉黑藻>伊樂藻，且差異顯著，主要是由于處理組中苦草具有較高的生物量和各部位較高的Cu含量。另外輪葉黑藻各對照組和Cu脅迫處理組各部位Cu累積量大小順序為葉部>莖部>根部，且各部位差異顯著；而伊樂藻葉部和莖部Cu累積量差異不顯著，但是均顯著大于根部累積量；苦草的Cu累積量則主要集中在葉部，根部只占極少一部分。說明不同植物不同部位Cu累積量存在一定差異，對于養(yǎng)殖塘底泥重金屬Cu污染修復(fù)來講，葉部累積量較大的沉水植物較適宜種植，因可通過定期收割地上部分來不斷降低底泥重金屬含量直至達(dá)到安全水平。

圖2 三種沉水植物不同部位Cu累積量特征

2.3 底泥中重金屬銅含量隨時間的動態(tài)變化

隨著沉水植物的生長和收割，Cu處理組底泥中Cu含量顯著下降，至實驗結(jié)束時，Cu處理組中由輪葉黑藻、伊樂藻和苦草修復(fù)的養(yǎng)殖塘底泥分別由初始(112.42±6.6) mg/kg下降至(49.15±4.4)、(59.65±4.2)和(45.62±2.8)mg/kg，三種沉水植物Cu去除率依次為(48.62±2.5)%、(39.27±2.1)%和(55.72±2.8)%，各處理組之間差異較顯著；而對照組底泥中含Cu含量則稍有下降，但下降趨勢較平緩且不顯著，其對應(yīng)去除率分別為(19.90±1.0)%、(21.88±1.2)%和(16.23±0.8)%(表3)。處理組中，經(jīng)輪葉黑藻和苦草富集后的底泥間Cu含量顯著低于伊樂藻，而輪葉黑藻和苦草組底泥Cu含量則差異不顯著。試驗結(jié)束時底泥中Cu含量與試驗開始的污染底泥相比皆呈顯著差異，說明底泥Cu污染有很大改善。

表3 三種沉水植物對底泥重金屬Cu的去除率

2.4 三種沉水植物抗氧化酶活性變化特征

圖3顯示了三種沉水植物在Cu脅迫下抗氧化酶活性隨時間變化特征。從圖中可以看出，在第一次收割時Cu處理組SOD活性與初始值相比顯著上升，隨后不同程度下降；而與對照組相比則顯著提高，在其后三次收割其提高并不明顯。Cu處理組POD活性在第一次收割時其相對于初始值顯著提高，此后其活性基本保持不變，且苦草稍大于輪葉黑藻，而兩者則顯著大于伊樂藻，另外Cu處理組的POD活性顯著高于各自對照組，而對照組在整個試驗周期內(nèi)POD活性基本保持不變。

圖3 三種沉水植物SOD和POD活性變化特征

2.5 三種沉水植物根際底泥脫氫酶活性變化情況

圖4顯示了三種沉水植物根際底泥脫氫酶活性的變化特征，可以看出，輪葉黑藻和苦草各對照組土壤脫氫酶活性在前兩次收獲(9月1日和30日)均快速增加，而自第三次收割(10月30日)后則開始緩慢下降，伊樂藻則整個生長周期逐漸增加至平穩(wěn)狀態(tài)，3個處理組脫氫酶活性均顯著低于對照組。這主要是由于剛剛種上沉水植物，作物的根際不是很發(fā)達(dá)，土壤中微生物的數(shù)量也不是很多，所以脫氫酶的活性較低。隨著植物的生長及根際環(huán)境的改變，脫氫酶活性的上升速度較快，之后隨著有機物的降解、植物產(chǎn)量及微生物量的增加，脫氫酶活性緩慢增加，輪葉黑藻、苦草和伊樂藻在第三次收割時均達(dá)到最高水平。隨著輪葉黑藻和苦草的生長、天氣轉(zhuǎn)冷脫氫酶活性逐漸降低，表明輪葉黑藻和苦草對沉積物中重金屬Cu污染物的修復(fù)能力也逐漸降低。而伊樂藻具有耐低溫生理特征，在低溫條件下生長良好，盡管溫度降低，但是根際活性較好，故脫氫酶活性仍緩慢增加至趨于平穩(wěn)，因此可以選擇伊樂藻在寒冷的冬季進(jìn)行底泥重金屬污染修復(fù)品種，為冬春季節(jié)或低溫條件下水體重金屬污染植物修復(fù)提供依據(jù)。而Cu脅迫下，各處理組脫氫酶活性均顯著低于各對照組，且脫氫酶活性增加較緩慢，至后期逐漸趨于平穩(wěn)。說明Cu會明顯抑制底泥脫氫酶活性，且隨著底泥Cu含量的逐漸降低，其抑制作用逐漸解除，活性越來越高。

圖4 三種沉水植物根際底泥脫氫酶活性變化特征

3 討論

生物量的大小是衡量植物修復(fù)潛力大小的一個重要指標(biāo)，測量植物生物量在重金屬脅迫下的變化也能反映出植物對重金屬的耐性大小[12，19]。試驗期間，苦草、輪葉黑藻和伊樂藻并未發(fā)生失綠、萎蔫和死亡等現(xiàn)象，說明三種沉水植物對底泥相對較高的Cu濃度均具有一定的耐受性，并未超出其耐受臨界值。收獲生物量大小順序依次為苦草>輪葉黑藻>伊樂藻，分析原因，主要是沉水植物生長除了與Cu抗脅迫性有關(guān)外，還與其自身生長環(huán)境密切相關(guān)，苦草和輪葉黑藻較適宜于在水溫為20～30 ℃內(nèi)生長，而伊樂藻較適宜低溫(10～15 ℃)環(huán)境生長，而本試驗期間，前三次收割時平均溫度均在20 ℃以上，僅最后一個月平均溫度約為15 ℃，同時由于輪葉黑藻和伊樂藻根部的退化，而苦草具有相對發(fā)達(dá)的根系，水生植物的根系越發(fā)達(dá)越利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

另外，植株不同部位對重金屬都有一定積累量，并且積累程度存在一定差異[20]。本研究中，一定Cu濃度下，根莖葉部富集Cu的能力是受限的，并不會隨著時間的延長而提高，因此通過定期收割地上多余生物體以促進(jìn)植物快速生長，從而達(dá)到快速富集底泥中重金屬Cu的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，三種沉水植物富集能力順序依次為苦草>輪葉黑藻>伊樂藻，均可作為底泥Cu污染修復(fù)植物，且對重金屬的吸收存在濃度效應(yīng)，即隨著環(huán)境中重金屬離子濃度的升高，植物富集的重金屬含量也會相應(yīng)增加，這與許多研究結(jié)果相一致[10-12]，如超累積植物蓖麻體內(nèi)Cu含量隨著Cu礦廢棄地土壤含量的增高而增高[21]。因此，不同植物對重金屬的耐性、吸收、轉(zhuǎn)運能力相差較大，在應(yīng)用沉水植物修復(fù)池塘底泥重金屬污染時應(yīng)根據(jù)植物特性和污染特征進(jìn)行針對性修復(fù)。通過本試驗結(jié)果可知，尤其是已知底泥有輕度Cu污染的淡水養(yǎng)殖塘，在不影響其正常生產(chǎn)，又能保證其生產(chǎn)效益的情況下，宜于春季種植苦草和輪葉黑藻，秋季宜種植伊樂藻，進(jìn)而通過定期收割以移除底泥中多余的Cu，達(dá)到底泥中Cu生物凈化或修復(fù)的效果。

植物超量累積重金屬是基于多種防御機制[22]。許多研究認(rèn)為，重金屬對植物的傷害與自由基的產(chǎn)生有關(guān)，生物體主要通過抗氧化酶系統(tǒng)防御自由基損傷[23]。SOD、POD等是植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)中幾種主要的保護酶，SOD作為超氧自由基清除劑，其活性高低與植物抗逆性大小有一定的相關(guān)性，在適度的逆境環(huán)境誘導(dǎo)下，SOD活性增加能提高植物的適應(yīng)能力[24-25]。POD是植物體內(nèi)分布較廣的一類氧化還原酶，具有重要的生理防護功能，如木質(zhì)素的形成伸展、蛋白的聚合、植物生長素的代謝、病毒的抵抗和創(chuàng)傷的愈合等[26-27]。在本實驗中，SOD和POD的活性出現(xiàn)一定程度的升高，這是植物體的保護性反應(yīng)，能有效地清除毒害所產(chǎn)生的活性氧，說明沉水植物對重金屬Cu脅迫具有一定的抗逆性能和適應(yīng)能力，根據(jù)SOD和POD活性可知適應(yīng)能力依次為苦草>輪葉黑藻>伊樂藻，這與上述三種沉水植物鮮重以及累積量結(jié)果相一致。同時，植物的生長會不斷激活土壤酶活性，土壤酶活性的升高又可促進(jìn)植物的生長，從而促進(jìn)植物對重金屬的轉(zhuǎn)化吸收，增強其富集能力[28-29]。本試驗亦發(fā)現(xiàn)，隨著三種沉水植物的不斷生長，其根際土壤脫氫酶活性逐漸恢復(fù)，但重金屬Cu對土壤脫氫酶的活性亦產(chǎn)生了不同程度抑制。對照組脫氫酶活性受溫度的影響較大，隨著溫度的逐漸降低，苦草和輪葉黑藻生長受限，脫氫酶活性受到一定抑制，呈現(xiàn)不斷降低趨勢，而伊樂藻生物量繼續(xù)增加，說明植物生長旺盛階段對脫氫酶的激活作用要大于溫度的抑制作用，因此其活性繼續(xù)緩慢的上升至穩(wěn)定狀態(tài)。而Cu處理組中，盡管溫度不斷下降抑制了脫氫酶活性，但隨著Cu含量的不斷降低，對脫氫酶活性的抑制作用大大減弱，從而抵消了溫度降低的抑制作用，提高了土壤脫氫酶的活性。因此，在利用沉水植物修復(fù)養(yǎng)殖塘底泥重金屬時應(yīng)盡量減弱外界環(huán)境因素對土壤酶的抑制作用，比如增加沉水植物的生長時間或增加其收割次數(shù)或選擇適宜其生長的溫度條件等以不斷增強土壤酶的活性，促進(jìn)植物生長進(jìn)而促進(jìn)吸收轉(zhuǎn)移底泥中過量的重金屬，又可不斷減輕重金屬對植物的脅迫作用。