彭 婕，呂 磊，喻亞麗，甘金華，何 力

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(武漢)，武漢 430223)

呋喃西林作為一類有效的抗菌藥物曾被廣泛運用在豬、牛等畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1]，氨基脲(semicarbazide，SEM)是其重要的代謝產(chǎn)物。因呋喃西林原藥在生物體內(nèi)快速代謝成SEM[2-3]，目前許多國家均以檢測SEM來判斷在養(yǎng)殖過程中是否非法使用呋喃西林，以達(dá)到對呋喃西林原藥監(jiān)控的目的[4]。呋喃西林及其代謝物SEM均被證明對哺乳動物具有遺傳毒性[5-7]，歐盟、日本及中國先后規(guī)定呋喃西林及其代謝物在動物源性食品中不得檢出[8]。近年來，國內(nèi)外頻繁在甲殼類水產(chǎn)品中檢出SEM殘留，我國在青蝦監(jiān)督抽查和蝦蟹苗種抽檢中也發(fā)現(xiàn)，SEM超標(biāo)現(xiàn)象較嚴(yán)重。

前期研究以中華絨螯蟹肌肉、性腺、肝胰腺、腮、蟹殼等不同組織為對象，分析了SEM在上述組織中的殘留情況，發(fā)現(xiàn)肌肉、性腺、肝胰腺和腮中幾乎沒有檢出SEM，而所有蟹殼樣品均檢出SEM且超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)，實驗證明中華絨螯蟹中存在內(nèi)源性SEM，且主要來源于蟹殼[9]，這一結(jié)論也在國內(nèi)外相關(guān)研究中得到證實[10-14]，但有關(guān)其產(chǎn)生途徑鮮有研究。蟹殼的主要成分為甲殼素、鈣鹽和蛋白質(zhì)，其中鈣與以蛋白質(zhì)為主的有機質(zhì)鑲嵌結(jié)合，層層交疊覆蓋在甲殼素的表面，因此探究蟹殼中SEM的主要來源，需研究蟹殼中甲殼素及蛋白質(zhì)含量變化對SEM殘留量的影響。本實驗以不同產(chǎn)地的中華絨螯蟹雄性及雌性個體的背部蟹殼和腹部蟹殼為研究對象，測定SEM在上述組織中的殘留水平，分析不同部位蟹殼中主要成分甲殼素、蛋白質(zhì)及其水解氨基酸等相關(guān)因素的分布規(guī)律，評估并驗證其與SEM殘留的相關(guān)性，以此探究中華絨螯蟹中內(nèi)源性SEM可能的產(chǎn)生途徑，為下一步研究其產(chǎn)生機理提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ThermoFinnigan Surveyor液相色譜系統(tǒng)和TSQ Quantum Access Max三重四級桿質(zhì)譜儀(美國 Thermo Fisher公司)；SHZ-28A水浴恒溫振蕩器(太倉市華美生化儀器廠)；CR21 離心機(日本 HITACHI)；KD200 氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)；K9840自動凱式定氮儀(濟南海能儀器股份有限公司)；L-8900氨基酸自動分析儀(日本 HITACHI)。

SEM鹽酸鹽和內(nèi)標(biāo)物SEM·HCl-13C-15N2(純度≥ 99 %，德國Dr. Ehrenstorfer公司)，甲醇、二甲基亞砜、乙酸乙酯、正己烷(色譜純，J.T.Baker公司)，醋酸銨(色譜純，J.T.Baker公司)，2-硝基苯甲醛(分析純，上海安譜公司)，鹽酸、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，甲殼素(純度≥ 98 %)、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、亮氨酸、精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA公司)，實驗用水由Milli-Q純水儀制備。

1.2 樣品檢測

1.2.1 樣品來源與制備

中華絨螯蟹樣品取自武漢市江夏區(qū)梁子湖山坡湖區(qū)(基地1)、武漢市漢南區(qū)湘口街五湖大隊(基地2)和洪湖市大同湖農(nóng)場(基地3)，三個基地的養(yǎng)殖水體和飼料等基質(zhì)中均未檢出呋喃西林原藥。每個基地選取雄蟹雌蟹各30只，雄蟹體重約100 ～ 120 g/只，雌蟹體重約70 ～ 90 g/只，分別取其腹部蟹殼和背部蟹殼，剪碎備用。

1.2.2 樣品中SEM濃度測定

樣品中SEM濃度測定的前處理及儀器分析方法參見文獻(xiàn)[9]。

1.2.3 樣品中甲殼素含量測定

采用文獻(xiàn)[15]方法將甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品烘干后加入濃硫酸水解4 h，待水解液冷卻至室溫后，經(jīng)MCX小柱凈化，濃縮后采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分別測定甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的水解產(chǎn)物氨基葡萄糖鹽酸鹽(GAH)濃度，再根據(jù)公式(1)計算待測樣品中甲殼素的含量。

X=(mGAH×m0)/(mS×m0-GAH)×100%

(1)

其中：X為樣品中甲殼素的含量(%)；mGAH為待測樣品水解后的GAH質(zhì)量(μg)；m0為甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(mg)；mS為待測樣品質(zhì)量(mg)；m0-GAH為甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品水解后的GAH質(zhì)量(μg)。

1.2.4 樣品中蛋白質(zhì)含量測定

稱取固體試樣0.2 g左右，與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，按相關(guān)方法進行測定[16]。

1.2.5 樣品中氨基酸含量測定

稱取一定量樣品于水解管內(nèi)，加入6 mol/L鹽酸10 ～ 15 mL，將蛋白質(zhì)徹底水解成游離氨基酸，用1 mL pH 2.2的檸檬酸緩沖液溶解，經(jīng)氨基酸自動分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮發(fā)生顏色反應(yīng)，再通過分光光度計比色測定氨基酸含量[17]。

1.2.6 相關(guān)性驗證實驗

根據(jù)甲殼素和氨基酸含量測定結(jié)果，確定2.00 g蟹殼樣品中甲殼素和氨基酸的重量，分別將上述重量的甲殼素、17種氨基酸混合物、甲殼素和17種氨基酸的混合物三組物質(zhì)作為待測樣品，按照1.2.2前處理和儀器測定方法來驗證是否有SEM檢出。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟹殼中SEM殘留水平分析

不同部位的蟹殼樣品測定結(jié)果如圖1所示(樣品平行測定3份，取平均值)。從圖1可以看出，3個基地不同部位的蟹殼中均有不同程度的SEM檢出，其檢出值均超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)。SEM在3個基地的檢出濃度分布趨勢基本一致，均為雄蟹背殼>雌蟹背殼>雄蟹腹殼>雌蟹腹殼。整體而言，雄蟹個體比雌蟹大，SEM在其背部和腹部的分布相對較多，而不同性別的中華絨螯蟹中背部蟹殼所含SEM水平明顯高于腹部蟹殼。不同取樣地點雄蟹背殼中SEM的檢出濃度變化規(guī)律為基地2>基地1>基地3，雄蟹腹殼和雌蟹腹殼中SEM的分布規(guī)律則為基地3>基地1>基地2，三個基地的雌蟹背殼中SEM檢出濃度基本相同。不同取樣地點同一類型的蟹殼中SEM檢出濃度雖無明顯變化規(guī)律，但其檢出值相差不大。

圖1 樣品中SEM的濃度

2.2 蟹殼中甲殼素與SEM殘留相關(guān)性分析

根據(jù)文獻(xiàn)方法測定濃度為0.1、1、5、10、50 mg/L的GAH標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線?；貧w方程為y=204 0x+277 1，R2=0.995。甲殼素的含量可以間接通過GAH含量表示，可采用添加GAH的方式考察方法的回收率和精密度。選取1個雄蟹背部殼(水解后GAH含量為2.39 mg/L)作為樣品，分別加入0.25、2.5、5.0 mg/L三個濃度水平的GAH，平行測定6個樣品，結(jié)果見表1，其回收率為80.3%～91.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～ 4.8%，說明方法回收率和精密度良好。

表1 回收率及方法精密度測定結(jié)果(n=6)

分別稱取0.02 g甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，HPLC-MS/MS法測得甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物GAH質(zhì)量為13.81 μg，待測樣品水解產(chǎn)物GAH的質(zhì)量及根據(jù)公式(1)計算的甲殼素含量如表2所示。此方法操作步驟簡單，且測定結(jié)果與文獻(xiàn)[18]中采用傳統(tǒng)方法測定的結(jié)果接近。3個基地不同部位蟹殼中甲殼素含量分布如圖2 所示，其分布趨勢均為雄蟹背殼>雌蟹背殼>雄蟹腹殼>雌蟹腹殼。甲殼素在生物體中的主要作用是作為身體骨架起到保護機體的作用，雄蟹骨架較大，其背部和腹部甲殼素含量自然高于雌蟹，而不同性別的中華絨螯蟹背部蟹殼比腹部蟹殼硬，其甲殼素含量相對較高。

表2 樣品中甲殼素的含量(n=3)

圖2 不同部位蟹殼中甲殼素含量分布圖

以SEM濃度和甲殼素含量繪制曲線，如圖3所示，大多數(shù)點分布在曲線上及周圍，曲線相關(guān)系數(shù)為正值(P< 0.05)，說明中華絨螯蟹蟹殼中SEM濃度與其中甲殼素的含量正相關(guān)，樣品中甲殼素含量越高，其SEM檢出濃度越高。

圖3 中華絨螯蟹不同組織中SEM濃度與甲殼素含量相關(guān)性分析

2.3 蟹殼中蛋白質(zhì)與SEM殘留相關(guān)性分析

雄蟹背殼、雄蟹腹殼、雌蟹背殼和雌蟹腹殼中蛋白質(zhì)含量結(jié)果如圖4所示。3個基地不同部位蟹殼中蛋白質(zhì)含量變化趨勢均為雌蟹腹殼>雄蟹腹殼>雄蟹背殼>雌蟹背殼。腹部蟹殼直接與肌肉組織相連，而肌肉組織中蛋白質(zhì)含量高達(dá)70%以上，受其影響，腹部蟹殼蛋白質(zhì)含量明顯高于背部蟹殼。

圖4 樣品中蛋白質(zhì)的含量

將不同部位蟹殼中蛋白質(zhì)含量與其SEM殘留濃度比較，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量最高的雌蟹腹殼中SEM檢出濃度最低，而蛋白質(zhì)含量相對較低的雌蟹背殼和雄蟹背殼中SEM檢出濃度卻相對較高。以SEM濃度和蛋白質(zhì)含量繪制曲線，如圖5所示，曲線相關(guān)系數(shù)為負(fù)值(P<0.05)，說明蛋白質(zhì)含量與SEM檢出濃度呈相反趨勢，這表明中華絨螯蟹蟹殼中SEM的生成與其蛋白質(zhì)的含量也可能相關(guān)，樣品中蛋白質(zhì)含量越高，其SEM檢出濃度越低。

圖5 中華絨螯蟹不同組織中SEM濃度與蛋白質(zhì)含量相關(guān)性分析

2.4 蟹殼中氨基酸與SEM殘留相關(guān)性分析

蛋白質(zhì)是由若干氨基酸經(jīng)過脫水縮合形成的，進一步分析，SEM的生成還可能與樣品中的氨基酸組成相關(guān)。3個基地不同部位蟹殼中蛋白質(zhì)分布規(guī)律一致，因此僅選取基地1樣品分析其中氨基酸組成，結(jié)果如表3所示。蟹殼中17種氨基酸的含量占干重的12.92%～29.99%，其中鮮味和甘味氨基酸含量非常豐富，包括天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等，占氨基酸總量的28.02%～34.02%。四種蟹殼中蛋氨酸含量最高，其次為谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和精氨酸。

根據(jù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)17種氨基酸的變化趨勢基本一致，均為雌蟹腹殼>雄蟹腹殼>雄蟹背殼≈雌蟹背殼，因此單從氨基酸測定結(jié)果很難直接推斷哪一種或哪幾種氨基酸與SEM的產(chǎn)生具有相關(guān)性，仍需通過下一步的驗證實驗來探明。

表3 氨基酸檢測結(jié)果(n=3)

Tab.3 Amino acid test results(n=3)i

氨基酸種類氨基酸含量/%雄蟹背殼雄蟹腹殼雌蟹背殼雌蟹腹殼天冬氨酸(Asp)0.941.900.952.65蘇氨酸(Thr)0.480.930.471.36絲氨酸(Ser)0.620.920.601.27谷氨酸(Glu) 1.262.541.223.78甘氨酸(Gly)0.901.460.942.12丙氨酸(Ala)0.661.480.600.62胱氨酸(Cys)0.260.480.290.62纈氨酸(Val)0.780.870.760.99蛋氨酸(Met)3.353.523.093.93異亮氨酸(Lle)0.310.680.300.95亮氨酸(Leu)0.601.340.561.94酪氨酸(Tyr)0.460.700.460.86苯丙氨酸(Phe)0.641.040.611.30賴氨酸(Lys)0.340.980.321.52脯氨酸(Pro)0.600.880.601.34組氨酸(His)0.240.440.240.60精氨酸(Arg)0.981.530.912.70總和13.4221.6912.9229.99

2.5 相關(guān)性驗證實驗結(jié)果分析

經(jīng)甲殼素和氨基酸的含量測定，確定2.0 g蟹殼中甲殼素的重量約為0.20 g，各種氨基酸重量約為0.04 g。三組物質(zhì)的驗證結(jié)果如表4所示。驗證實驗發(fā)現(xiàn)甲殼素經(jīng)前處理后未檢出SEM，究其原因可能是因為甲殼素為高含碳物質(zhì)，氮元素含量較少，而SEM是高含氮物質(zhì)，因此甲殼素轉(zhuǎn)化為SEM的可能性較低。17種氨基酸混合物經(jīng)前處理后SEM檢出值為0.77 μg/kg，與蟹殼中SEM檢出濃度相差較大，導(dǎo)致其檢出的原因可能是同位素內(nèi)標(biāo)引起的干擾[19]。甲殼素與17種氨基酸混合物經(jīng)前處理后SEM檢出值為10.28 μg/kg，與蟹殼中SEM檢出濃度較為接近，由此推斷蟹殼中SEM檢出可能是甲殼素和氨基酸在SEM測定前處理過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致中華絨螯蟹中存在內(nèi)源SEM，這一猜測2014年Colin C[20]也提到過，但從未被證實，本研究首次驗證了這一假想的可能性。下一步進行機理研究時，需首先明確具體是哪種或哪幾種氨基酸與甲殼素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，能夠?qū)е耂EM檢出且超標(biāo)，然后確定反應(yīng)過程的中間產(chǎn)物，從而探明中華絨螯蟹中SEM的產(chǎn)生機理。

表4 不同樣品中SEM的濃度(n=3)

注：“ND”表示檢測結(jié)果小于0.50 μg/kg，“/”表示無。

3 結(jié)論

本實驗系統(tǒng)分析了中華絨螯蟹雄性與雌性個體不同部位的蟹殼中SEM的殘留水平、甲殼素含量、蛋白質(zhì)含量以及氨基酸組成，結(jié)果表明不同部位蟹殼中甲殼素含量與SEM殘留水平變化趨勢一致，蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成與SEM殘留水平變化趨勢相反，以此推斷甲殼素和蛋白質(zhì)及其水解氨基酸可能與SEM的形成具有相關(guān)性。驗證實驗進一步證實，甲殼素和氨基酸在前處理過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生SEM，這一產(chǎn)生途徑可能是導(dǎo)致中華絨螯蟹中內(nèi)源性SEM殘留的原因。