施曉杰,馬維超,鄧昱晨,鄧 偉,張 倩,馮 波,穆祥

[1.北京農(nóng)學院動物科技學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室,北京 昌平 102206；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀 100193]

血管內(nèi)皮細胞可調(diào)節(jié)機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,具有分泌、合成、代謝及免疫功能,可產(chǎn)生多種細胞因子和生物活性物質(zhì)[1]。不同于大血管內(nèi)皮細胞,在不同組織器官之間,微血管內(nèi)皮細胞在表型和功能上均表現(xiàn)出差異性[2]。腸微血管內(nèi)皮細胞襯附于腸絨毛血管內(nèi)壁,呈網(wǎng)囊狀,是血管內(nèi)外物質(zhì)交換的重要屏障和各種腸內(nèi)毒素入血的必經(jīng)通路。目前關(guān)于豬腦微血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)方法已有諸多報道,但是尚未有成熟的豬小腸微血管內(nèi)皮細胞(PIMVECs)分離方法的相關(guān)研究。因此本試驗嘗試采用酶消化法和免疫磁珠分選法,建立一套成熟的分離PIMVECs的方法。

1 材料

1.1 實驗動物 英系長白SPF新生仔豬,購自北京市SPF豬育種管理中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2018—0007。

1.2 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱(SANYO公司,MCO17AC)；多功能酶標儀(BIOTEK公司,SYNERGY4)；熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS,IX71A21PH)；磁珠分選儀(Thermo公司,710)；澳洲胎牛血清(Gibco公司,1099141)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司,1930009)；青鏈霉素(Gibco,15140122)；胰蛋白酶(Sigma公司,03126)；I型膠原酶(Gibco公司,17100-017)；DAPI染色液(Bioss公司,C-0033)；WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,C0035)；抗小鼠IgG磁珠(In-vitrogen公司,11531D)；小鼠抗豬CD31(Novusbio公司,10065336)；FITC標記羊抗兔IgG(Abbine公司,A23220)；兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體(CUSABIO公司,P00451)。

2 方法

2.1 細胞的分離 取新生SPF長白仔豬,麻醉后用75%酒精全身消毒,在超凈臺中無菌取出空腸段,將其置于含有10%青鏈霉素的冷D-Hank′s浸泡10 min,剔除漿膜層和肌層。將腸段剖開截成3 cm小段,用D-Hank′s清洗數(shù)次,直至洗液澄清。刮取腸絨毛,收集于15 mL離心管,加入D-Hank′s,1 200 r/min離心5 min,棄上清及粘液層。將沉淀移入50 mL離心管,按1∶1∶3的比例添加胰蛋白酶、I型膠原酶、DMEM。以上試驗步驟均在冰板上操作。將離心管置于旋轉(zhuǎn)搖床室溫消化,期間每隔一段時間在顯微鏡下觀察組織消化狀態(tài),防止消化過度。消化完全后加入等量含20%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。消化液過100、200目細胞篩網(wǎng),1 200 r/min離心收集細胞。取部分細胞直接接種于六孔板,待細胞長滿后純化。

2.2 細胞的純化 取25 μL磁珠,用Buffer 1(含0.1%BSA 的 PBS)吹洗3 次,加入20 μL(1∶100)小鼠抗豬CD31抗體后混勻,4℃孵育過夜。將過夜后的磁珠移入深孔板,在磁珠分選儀上用Buffer 1清洗3次,收集磁珠于EP管中。用Buffer 2(0.1%BSA和2 Mm EDTA的PBS)重懸細胞,稀釋為1×107個/mL的細胞懸液,加入磁珠混勻,4℃ 孵育20 min,每隔5 min震蕩。將細胞移入深孔板,用Buffer 1在磁珠分選儀上連續(xù)分選3次,將分選后的細胞收集到含Buffer 3(0.1%BSA、1 mmol/L CaCl2和 5 mmol/L MgCl2的PBS)的EP管中,加入Releasing Buffer室溫孵育15 min分離目的細胞和磁珠。將孵育好的混懸液加入深孔板,用磁珠分選儀吸棄磁珠。吸取深孔板內(nèi)純化后的細胞接種于六孔板,2 h后換液,用差速貼壁的方法進一步優(yōu)化細胞。此后每2 d換液1次。

2.3 細胞的鑒定 采用免疫熒光法檢測所分離細胞上的Ⅷ因子。將培養(yǎng)的第二代細胞接種于24孔板,待細胞長滿80%時,PBS洗滌3次,4%多聚甲醛(4℃)固定20 min。PBS洗滌細胞3次,滴加兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體(1∶200),4℃過夜孵育。陰性對照組用PBS代替Ⅷ因子。抗體孵育結(jié)束后,PBS洗滌3次,滴加FITC標記羊抗兔IgG(1∶200),室溫避光孵育 1 h,加入 DAPI(1∶300)孵育5 min。孵育結(jié)束后,PBS洗滌3次,加入封片劑,于熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照。

2.4 WST-1試劑盒檢測純化后細胞的增殖能力

將純化后的細胞消化后接種96孔板中,細胞密度為1×104個/孔,每個時間點接種6個復孔,同時設(shè)空白對照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng),每隔24 h加入WST-1,繼續(xù)培養(yǎng)1 h后用酶標儀測定450 nm波長處OD值,未測定細胞每隔2 d換液。比色時用空白對照孔平均值調(diào)零,以培養(yǎng)時間為橫坐標,平均光吸收度為縱坐標,以單點標示出每日細胞吸光度檢測平均值,繪制細胞生長曲線。

2.5 細胞的凍存與復蘇 將第5次傳代后的細胞,按照梯度凍存法凍存[3]。30 d后取出凍存管復蘇細胞,接種于6孔培養(yǎng)板,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察復蘇后細胞的形態(tài)及生長情況的變化。

2.6 統(tǒng)計學處理 試驗結(jié)果采用Graphpad Prism6軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料均以ˉ±s表示。

3 結(jié)果

3.1 細胞的分離 清洗后的腸黏膜表面無黏液,腸絨毛張開(見封底彩版圖1A),刮取腸黏膜層收集腸絨毛(見封底彩版圖1B)。經(jīng)復合酶消化后腸絨毛斷裂,消化液中出現(xiàn)大量細胞即為消化完全(見封底彩版圖1C)。離心消化液,沉淀過篩后即為未純化的PIMVECs(見封底彩版圖1D)。

圖1 PIMVECs分離

3.2 細胞形態(tài)觀察 純化的PIMVECs培養(yǎng)1 d后,倒置顯微鏡下可見貼壁細胞呈短梭形或三角形,形態(tài)清晰,大小均勻,反光較強。3 d后培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁細胞分裂增殖,呈單層生長。7 d后貼壁細胞長滿細胞皿,呈現(xiàn)出較為典型的內(nèi)皮細胞形態(tài),細胞逐漸融合,形成“鋪路石樣”,出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象,視野中細胞形態(tài)勻一,未發(fā)現(xiàn)其他細胞形態(tài)。

未純化的PIMVECs培養(yǎng)1 d后鏡下可見長、短梭形和多邊形細胞,形態(tài)清晰；3 d后細胞鋪滿培養(yǎng)皿,呈單層生長,細胞伸出偽足,呈多邊形,未形成典型“鋪路石樣”；純化時細胞吸附磁珠較少,純化后的細胞數(shù)量稀少,死亡較多,貼壁細胞顏色加深,細胞核體積增大。

3.3 PIMVECs的鑒定 免疫熒光法檢測Ⅷ因子相關(guān)抗原呈陽性,視野中細胞胞漿呈現(xiàn)綠色熒光(見封底彩版圖2A),DAPI染色后細胞核均呈現(xiàn)藍色熒光(見封底彩版圖2B),陽性細胞數(shù)超過95%。對照組中細胞未呈現(xiàn)綠色熒光(見封底彩版圖2D)。

圖2 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定(40×)

3.4 WST-1試劑盒檢測PIMVECs的增殖情況用WST-1試劑盒測定PIMVECs的生長狀況,使用Graphpad Prism6軟件繪制生長曲線,發(fā)現(xiàn)3 d達到對數(shù)生長期,5 d達到平臺期(圖3)。

圖3 PIMVECs的生長曲線

3.5 凍存對PIMVECs形態(tài)及生長的影響 復蘇后的細胞在2 h內(nèi)完成貼壁,6 h后細胞完全伸展,以梭形和鋪路石狀種狀態(tài)存在,形態(tài)清晰,說明純化后的細胞具有良好的儲存能力,復蘇后仍具有很強的細胞活性。

4 討論與結(jié)論

養(yǎng)豬業(yè)是我國養(yǎng)殖業(yè)重要組成部分,而豬病在近幾年給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。臨床常見豬病大多伴發(fā)腸道反應,比如豬水腫病可引起腸道組織水腫,豬流行性腹瀉的剖檢眼觀變化僅限于小腸病變。通過對引起腸道病變的腸毒素等毒力因子的研究發(fā)現(xiàn),微血管內(nèi)皮細胞的異常反應可能是引起腸道病變的主要原因[4]。微血管內(nèi)皮細胞不僅具有物理屏障作用和生物學功能,而且具有組織器官特異性。自1980年P(guān).M.Davison成功分離了內(nèi)皮細胞(MVECs)[5]以后,不同物種不同器官的MVECs原代培養(yǎng)技術(shù)不斷創(chuàng)新改進,其中人和鼠的心臟、肺臟和腸道的微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)相當成熟[6],而豬小腸微血管內(nèi)細胞的分離培養(yǎng)鮮有報道。由此可見,基于在細胞水平上深入研究豬消化道疾病的發(fā)生機制,建造病理模型,PIMVECs的分離純化培養(yǎng)顯得尤為重要。

目前,國際上存在的微血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)方法多為植塊法和酶消化法,不同部位的微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)要求也不一致。相比用植塊法培養(yǎng)肺微血管內(nèi)皮細胞,腸絨毛容易夾帶菌體且富含外泌細胞,組織塊貼壁不牢,因此細胞爬出較慢,并且爬出細胞中成纖維細胞及其他雜細胞較多,后期傳代過程中不易去除,難以維持目的細胞后期的優(yōu)勢生長,所以腸組織不宜使用植塊法。酶消化法雖然較植塊法復雜,而且消化時間和酶濃度難以把握,但可在短時間內(nèi)獲得大量細胞,因此適合于持續(xù)免疫磁珠純化試驗。

據(jù)報道,動物在剛出生時,其胃腸道中是無菌的,但出生后的4 h左右,微生物就能在消化道內(nèi)定植和繁殖[7]。仔豬剛出生時,通過母體產(chǎn)道時獲得了母體的微生物,之后通過生長環(huán)境接觸各種微生物,并經(jīng)過與宿主的相互適應和選擇,逐漸形成復雜的胃腸道內(nèi)菌群生態(tài)系統(tǒng)[8]。因此PIMVECs的原代分離培養(yǎng)純化盡量選取新生仔豬,從而降低細胞污染風險。由于腸黏膜表面的黏液會降低細胞過篩率,并且容易裹挾細菌,純化過程中粘附免疫磁珠,影響磁珠與細胞的結(jié)合效率,因此取材腸段要多次清洗至腸絨毛分散,洗液清亮。通過優(yōu)化消化酶的比例搭配,將消化下來的細胞直接進行免疫磁珠純化,可一次性短時間內(nèi)獲得大量高純度PIMVECs。多次試驗發(fā)現(xiàn),未純化細胞因雜細胞較多,成纖維細胞較微血管內(nèi)皮細胞更易生長分裂,細胞長滿時即不能形成“鋪路石樣”?！颁伮肥瘶印笔莾?nèi)皮細胞有別于其他細胞的特征性細胞形態(tài),但是在多次傳代培養(yǎng)后的內(nèi)皮細胞,形態(tài)常由“鋪路石樣”轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮魏投嘟切蝃9-10]。我們在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),“鋪路石樣”存在于細胞前2代,后期細胞形態(tài)根據(jù)培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基中血清濃度和傳代方式等因素逐漸轉(zhuǎn)變。因此,細胞形態(tài)可作為鑒定微血管內(nèi)皮細胞的參考指標,主要還是通過免疫細胞化學進行鑒定。

本試驗選擇CD31因子對目的細胞進行捕捉純化。研究表明,內(nèi)皮細胞表面標記CD31、CD102的高表達僅限于1～3代[11]。本次試驗中,將組織分離的細胞進行傳代增殖培養(yǎng)再純化,因在傳代培養(yǎng)過程中PIMVECs未能形成優(yōu)勢生長,且PIMVECs表面CD31抗原標志物表達降低,在純化過程中磁珠較難捕捉到目的細胞,故純化出的細胞數(shù)量稀少,活性較差,少數(shù)貼壁細胞趨于老化生長,增殖能力減弱。相比于前者,直接對組織消化后的單細胞進行陽性分離,減少了原代細胞培養(yǎng)周期和試劑投入,同時保持目的細胞活性和表面標志物的高表達,提升目的細胞與磁珠的結(jié)合效率,增加純化細胞的檢出量,后期結(jié)合Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性表達,細胞純度可達95%以上。此方法在磁珠分選過程中對目的細胞進行多次清洗,減少了細菌污染的機率。磁珠純化儀的原理與磁性分離架相同,因此在不具備磁珠純化儀的情況下亦可使用磁力架進行后續(xù)的細胞純化。

WST-1是一種類似于MTT的化合物,比MTT更加穩(wěn)定,線性范圍更寬,靈敏度更高。WST-1在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內(nèi)的一些乳酸脫氫酶還原成橙黃色的甲臜(Formazan)。細胞增殖越多越快,則顏色越深。配合酶標儀測定的吸光度值可直觀準確的反應活細胞量。

綜上所述,本研究成功建立了一種快速高效分離豬小腸微血管內(nèi)皮細胞的方法。通過此方法獲得的豬腸微血管內(nèi)皮細胞生長快,數(shù)量多,周期短。