賈紀(jì)萍,陳曉蘭,金禮琴,丁 寧,丁詩(shī)晴

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

楊樹花為楊柳科植物毛白楊、加拿大楊或同屬數(shù)種植物的干燥雄花序,楊樹花口服液為楊樹花經(jīng)提取制成的合劑[1],為紅棕色的澄明液體,主要藥用成分為酚苷類化合物和黃酮類化合物[2],化學(xué)成分包括芹菜素、山奈酚、水楊苷、木犀草素等[3]。楊樹花口服液功能是清熱解毒、澀腸止瀉、化濕止痢、健脾養(yǎng)胃,用于馬、牛、羊、豬等,可提高仔畜存活率,主要用于治療仔豬濕熱下痢[4]。

《中華人民共和國(guó)獸藥典》(二〇一五年版,二部)中收載的楊樹花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中【鑒別】項(xiàng)下只有與楊樹花對(duì)照藥材的薄層色譜鑒別,缺少其中有效成分的薄層鑒別和含量測(cè)定,其他關(guān)于楊樹花口服液檢測(cè)的文獻(xiàn)資料也較少,不能有效控制目前市場(chǎng)上楊樹花口服液的質(zhì)量。本研究對(duì)楊樹花口服液中芹菜素等有效成分進(jìn)行深入分析,以期為完善楊樹花口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 紫外可見分光光度計(jì)(UV1800PCDS),購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司；電熱恒溫水槽(DK-80),購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超聲波清洗器(KH5200B),購(gòu)自昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；電子天平(YP2001N),購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵,購(gòu)自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；LC20A高效液相色譜儀,購(gòu)自日本島津公司；BT25S電子天平(0.01 mg),購(gòu)自賽利多斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；雙槽展開缸,購(gòu)自瑞士卡瑪公司；硅膠HSG板,購(gòu)自煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所。

1.2 試劑 乙酸乙酯、甲苯、甲酸、三氯化鋁、磷酸、乙醇、均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水,為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 藥物準(zhǔn)備 對(duì)照品：槲皮素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào) 100081-201408,含量：99.1%),木犀草素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)：111520-201605,含量：99.6%)；芹菜素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)：111901-201603,含量：99.2%)。

楊樹花口服液樣品：委托揚(yáng)中牧樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 取楊樹花口服液5 mL,用乙酸乙酯分兩次提取,每次10 mL,合并乙酸乙酯層,蒸干,殘?jiān)蛹状? mL溶解,作為供試品溶液。另取芹菜素對(duì)照品、木犀草素對(duì)照品、槲皮素對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 mL含0.1 mg溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)獸藥典》二〇一五年版二部附錄0502)試驗(yàn),吸取上述四種溶液各3 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠HSG薄層板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以2%三氯化鋁乙醇溶液,105℃加熱,取出置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

圖1 薄層色譜法鑒別

2.2 總黃酮測(cè)定 參照居羚和《中國(guó)藥典》(二〇一五年版一部)中“天南星”[5]方法制定楊樹花口服液中總黃酮測(cè)定方法質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取芹菜素對(duì)照品適量,精密稱定,加60%乙醇制成每1 mL含12.25 μg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取楊樹花口服液5 mL,置于50 mL量瓶中,用60%乙醇稀釋,并定容至刻度；從此瓶中精密吸取1 mL溶液置具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)45 min,放冷,再稱定重量,用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液1 mL,置10 mL量瓶中,加60%乙醇至5 mL,加1%三乙胺溶液至刻度,搖勻,以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外-可見分光光度法(《中國(guó)獸藥典》二〇一五年版二部附錄0401),在400 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取芹菜素對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 mL,分別置 10 mL 量瓶中,各加 60%乙醇至5 mL,加1%三乙胺溶液至刻度,搖勻,以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外 -可見分光光度法在400 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以芹菜素對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.1004X+0.01340(R2=0.999 93),結(jié)果表明,芹菜素在1.225～6.125 μg/mL與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下方法操作,測(cè)定同一供試品溶液在不同時(shí)間的吸光度。結(jié)果表明,吸光度在5～90 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 取已知總黃酮含量的供試品溶液5.0 mL于50 mL量瓶中,再加入12.25 mg/mL的芹菜素對(duì)照品溶液4 mL,按2.2.2項(xiàng)下方法測(cè)定,結(jié)果平均回收率為100.4%,RSD為1.66%(n=6)。

2.2.6 樣品中總黃酮的含量測(cè)定 取3批楊樹花口服液樣品按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定吸光度后代入2.2.3項(xiàng)下線性方程中計(jì)算出濃度,測(cè)定得楊樹花口服液中總黃酮以芹菜素計(jì)為10.3 mg/mL。

2.3 木犀草素含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Allti-ma C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相為甲醇 -0.4% 磷酸(48∶52)[6]；流速為 1.0 mL/min；進(jìn)樣量為 20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm；柱溫為30℃。在上述件下進(jìn)行測(cè)定楊樹花口服液樣品中木犀草素峰峰形對(duì)稱,與其他組分分離度好,理論塔板數(shù)≥6 000,結(jié)果見圖2、圖 3。

圖2 木犀草素對(duì)照品溶液色譜圖

2.3.2 溶液的制備 對(duì)照品貯備液的制備 取木犀草素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含木犀草素164 μg的溶液,作為對(duì)照品貯備液。

精密吸取上述木犀草素貯備液2 mL于20 mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,制成每1 mL含木犀草素16.4 μg的對(duì)照品溶液。

圖3 楊樹花口服液供試品溶液色譜圖

供試樣品液的制備：精密吸取楊樹花口服液5 mL,用乙酸乙酯分兩次提取,每次10 mL,合并乙酸乙酯層,蒸干,殘?jiān)蒙V甲醇溶解后,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶并定容,搖勻,濾過,濾液過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取木犀草素貯備溶液 0.5、1、2、2、4 mL 分別置 20、20、20、10、10 mL量瓶中,加色譜甲醇稀釋至刻度,搖勻,依次注入液相色譜儀,測(cè)定峰面積。以對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=687 96X+14 642(R2=0.999 8),結(jié)果表明,木犀草素在4.1～164.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為16.4 μg/mL的木犀草素對(duì)照品溶液20 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,分別測(cè)定峰面積,RSD為1.67%(n=6),結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取楊樹花口服液5 mL,按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.3.1項(xiàng)色譜條件,分別在于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣,測(cè)定木犀草素峰面積,RSD值為2.62%,結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批楊樹花口服液按2.3.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按2.3.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定,記錄木犀草素峰面積,RSD值為1.98%(n=6),結(jié)果表明該方法測(cè)定供試樣品重現(xiàn)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取已知含量的楊樹花口服液9份,分別精密加入濃度為32.8的μg/mL 的木犀草素對(duì)照品溶液 2.5、2.5、2.5、5、5、5、7.5、7.5、7.5 mL,按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.3.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定,計(jì)算回收率。見表1,結(jié)果表明本方法的準(zhǔn)確度較好。

表1 楊樹花口服液中木犀草素加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.3.8 樣品中木犀草素的含量測(cè)定 取3批楊樹花口服液樣品,按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.3.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定,記錄木犀草素峰面積,依照標(biāo)準(zhǔn)曲線中線性回歸方程計(jì)算樣品中木犀草素的含量,測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 楊樹花口服液中木犀草素含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

現(xiàn)有資料中關(guān)于楊樹花口服液介紹的文獻(xiàn)只有7篇,其中只有1篇文獻(xiàn)涉及楊樹花口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為采用高效液相色譜法測(cè)定楊樹花口服液中水楊苷的含量[8]；因缺少楊樹花對(duì)照藥材的研制單位,無法采購(gòu)其對(duì)照藥材,故文中鑒別部分無對(duì)照藥材對(duì)照。

3.1 薄層鑒別 在薄層色譜法鑒別試驗(yàn)中,考察了藥典方法中的乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水(6.5∶4∶0.8∶0.8)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(10∶54∶0.5)[8]、乙酸乙酯-甲酸-水(7∶2.5∶2.5)[9]和甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶4∶0.2)[10],最終確定本研究所用展開體系為甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶4∶1)；考察了不同的類型的薄層板：硅膠H板、硅膠G板、硅膠GF254板和硅膠HSG板,結(jié)果表明,硅膠HSG板效果最好,木犀草素和槲皮素分離效果好,目標(biāo)斑點(diǎn)清晰。

3.2 總黃酮 總黃酮測(cè)定中樣品處理常用方法有超聲處理和加熱回流處理文獻(xiàn)方法[11]顯示超聲提取效果優(yōu)于加熱回流提取；另外借鑒《中國(guó)藥典》中方法中“精密量取供試品溶液5 mL,置具塞錐形瓶中,加1%三乙胺溶液至刻度,搖勻”,測(cè)試時(shí)供試品吸光度大于1,故調(diào)整取樣量為1 mL。

3.3 含量測(cè)定 木犀草素含量測(cè)定樣品提取過程中采用乙酸乙酯萃取時(shí),分層效果不好,采用了加熱和超聲兩種方法進(jìn)行處理,試驗(yàn)結(jié)果表明,樣品超聲比加熱測(cè)得的木犀草素含量高。對(duì)流動(dòng)相組成考察時(shí)發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸水體系[12]槲皮素和木犀草素?zé)o法分開,分離度較差,故采用甲醇-磷酸水體系。