王昌建，彭 志*，王衛(wèi)國(guó)，唐小明，魯杏華，林 源，鄧國(guó)華，何世成

(1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長(zhǎng)沙 410014；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069)

H10 亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是危害公共衛(wèi)生安全的潛在隱患，不僅能夠感染家禽和野鳥(niǎo)，還能夠感染海豹與野生犬類(lèi)等多種哺乳動(dòng)物[1-3]，某些歐亞分支與北美分支的H10 亞型AIV 對(duì)雪貂呈現(xiàn)出一定的致病性[4]。1949年，德國(guó)首次在雞體內(nèi)分離出 H10 亞型流感病毒[5]，此后H10 亞型AIV 在陸生家禽和水生鳥(niǎo)類(lèi)中的分離頻率越來(lái)越高。目前感染人的H10 亞型AIV 包括H10N7與H10N8 亞型，分別在埃及、澳大利亞和中國(guó)有報(bào)道，感染患者均與家禽有過(guò)密切接觸史[6-8]，而全球范圍內(nèi)暫未有H10 亞型AIV 持續(xù)人傳人的報(bào)道。

活禽交易市場(chǎng)中AIV 基因突變和重組頻繁，對(duì)AIV 的傳播和進(jìn)化起著非常關(guān)鍵的作用，本實(shí)驗(yàn)在湖南省主要活禽市場(chǎng)的禽流感(AI)持續(xù)監(jiān)測(cè)中，從健康的鴨體內(nèi)分離出一株H10N1 亞型AIV，對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序和遺傳演化分析，以及對(duì)小鼠的感染性試驗(yàn)，為我國(guó)H10 亞型AIV 的綜合防控提供相應(yīng)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究所用H10N1 亞型AIV A/duck/Hunan/S10078/2015 (H10N1)，簡(jiǎn) 稱(chēng) 為HuN/78/15，由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存；10日齡SPF 雞胚購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；6 周齡雌性BALB/c 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑 H1～H16 亞型AIV 血清購(gòu)自哈爾濱維科公司；病毒RNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；DNA 聚合酶和 DL2000 DNA Marker 購(gòu)自TaKaRa 公司；膠回收試劑盒購(gòu)自 OMEGA 公司；DNA 測(cè)序試劑盒購(gòu)自Applied Biosystem 公司。

1.3 病毒的增殖及雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定將 HuN/78/15 經(jīng) 10 倍倍比稀釋后接種于 10日齡SPF 雞胚，在 37 ℃孵育 48 h，4 ℃過(guò)夜，收獲雞胚尿囊液，利用血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)無(wú)其它亞型病毒混合后，繼續(xù)下次純化，共純化3 代后進(jìn)行病毒擴(kuò)增；增殖后的病毒10 倍倍比稀釋后經(jīng)雞胚尿囊腔接種5枚 10日齡SPF 雞胚，37 ℃培養(yǎng) 48 h 后收集尿囊液測(cè)定血凝價(jià)(HA)，根據(jù) Reed-Muench 法計(jì)算 EID50。

1.4 分離病毒全基因組測(cè)序與遺傳演化分析 按照病毒RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取傳代純化后的HuN/78/15 的病毒RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，參照 Hoffmann[9]等的引物，PCR擴(kuò)增病毒的 8 個(gè)基因節(jié)段，回收產(chǎn)物純化，利用ABI 公司的測(cè)序反應(yīng)試劑盒BigDye Terminator 3.1進(jìn)行病毒的全基因序列測(cè)定。序列經(jīng)過(guò)DNAStar 軟件拼接后，利用 MegAlign 進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA5.0 軟件繪制HA 基因進(jìn)化樹(shù)。

1.5 病毒對(duì)BALB/c 小鼠的感染試驗(yàn) 將8 只6 周齡BALB/c 小鼠輕度麻醉后，每只小鼠通過(guò)鼻腔接種 50 μL 106EID50的病毒稀釋液，另設(shè) 5 只 BALB/c小鼠接種等體積PBS 作為對(duì)照組。感染組接種后3 d隨機(jī)迫殺3 只小鼠，按順序采集腦、鼻甲、脾臟、腎臟、肺臟進(jìn)行病毒滴定，其余5 只小鼠與對(duì)照組小鼠連續(xù)觀察14 d，記錄每天的體質(zhì)量變化情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 HA基因的測(cè)序及演化分析 病毒株HuN/78/15的基因測(cè)序結(jié)果顯示，其 HA 基因全長(zhǎng) 1 683 bp，編碼561 個(gè)氨基酸，裂解位點(diǎn)為 IIQER↓GLFG，僅含一個(gè)堿性氨基酸，為低致病性禽流感病毒(LPAIV)的分子特征。HA 基因含有7 個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，分別為29NGT31、45NAT47、52NTS54、252NIT254、306NLS308、422NWT424、494NNT496；參照 H3 亞型 AIV 的HA 基因比對(duì)后，病毒株 HuN/78/15 的 HA 基因第226 位與第228 位分別為谷氨酰胺(Q)和甘氨酸(G)，具有結(jié)合禽源受體的分子特征；遺傳演化分析結(jié)果顯示，HuN/78/15 的HA 基因位于歐亞分支，與其同源性最高的病毒株為越南分離株A/duck/Vietnam/OIE-0483/2012(H10N7)，同源性為 97 %(表1)，推測(cè)其HA 基因可能與該病毒有相同的進(jìn)化來(lái)源，將HuN/78/15 的 HA 基因與 2013年江西省人感染的H10N8 病毒 A/Jiangxi-Donghu/346/2013 (H10N8)，以及 2013年江西家禽感染的 H10N8 病毒 A/duck/Jiangxi/6648/2013(H10N8)的 HA 基 因進(jìn) 行比對(duì) ，同源性分別為84.3%與85.1%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖1)。

2.2 NA 基因與內(nèi)部基因的測(cè)序及演化分析 測(cè)序結(jié)果顯示病毒株HuN/78/15 的NA 基因全長(zhǎng)為1 410 bp，編碼470 個(gè)氨基酸，存在7 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別為50NQS52、58NNT60、63NQT65、68NIS70、88NSS90、146NGT148、235NGS237，不存在莖部缺失情況。遺傳演化分析結(jié)果顯示，HuN/78/15 的NA 基因位于歐亞分支，與其同源性最高的病毒株為越南分離株A/teal/VietNam/MBP5/2006(H5N1)，同源性為 94 %；內(nèi)部基因來(lái)源復(fù)雜，其中PB2 與PB1 基因與H7N9、PA 與 NP 基因與 H4N6、M 基因與 H3N2、NS 基因與H11N7 亞型AIV 分別具有最高的核苷酸同源性(表1)，表明 HuN/78/15 的內(nèi)部基因可能與多個(gè)亞型的AIV 發(fā)生了基因交換。

2.3 HuN/78/15 對(duì)BALB/c 小鼠的感染試驗(yàn)結(jié)果病毒分離株 HuN/78/15 以106EID50的劑量鼻腔接種小鼠后，感染組小鼠在觀察期未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，在感染后的1 d～6 d 出現(xiàn)體質(zhì)量的輕微下降，最大下降8 %，感染第7 d 開(kāi)始體質(zhì)量逐步回升(圖2)，在迫殺的感染小鼠的鼻甲和肺臟中能夠檢測(cè)到病毒的復(fù)制，病毒滴度分別為5.17 log10 EID50與 5.67 log10 EID50，其它臟器中未檢測(cè)到病毒(圖3)，表明分離株 HuN/78/15 對(duì)小鼠呈低致病性。

圖1 HuN/78/15 株的HA 基因進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phyogentic tree based on HA gene of HuN/78/15

表1 病毒株HuN/78/15 各基因節(jié)段最高同源性病毒株Table 1 The highest homologous strain of each gene segment of HuN/78/15

圖2 小鼠感染病毒后的體重變化情況Fig.2 Weight change of mice after inoculated with virus

圖3 人工感染3 d 后小鼠臟器病毒滴定結(jié)果Fig.3 Virus titration in mice organs at 3 days post artificial infection

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，分離株HuN/78/15 的裂解位點(diǎn)處僅有一個(gè)堿性氨基酸，符合LPAIV 的分子特征，其 HA 基因 226(Q)與 228(G)位點(diǎn)，PB2 基因627(E)與 701(D)位點(diǎn)[10]，表明 HuN/78/15 傾向結(jié)合禽源受體。小鼠在感染 HuN/78/15 后體質(zhì)量呈一過(guò)性的輕微下降，病毒也僅在感染小鼠的肺臟和鼻甲中復(fù)制，表明該病毒株對(duì)小鼠呈低致病性，與上述的LPAIA 子特征相一致。El-Shesheny 等在最近的研究中指出 H10N1 亞型AIV 不需要提前適應(yīng)就能夠在小鼠的肺臟、鼻甲、心臟、肝臟等組織有效復(fù)制，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致，其后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究顯示，H10N1 雖然僅表現(xiàn)出對(duì) α-2，3 受體的結(jié)合能力，但在A549 細(xì)胞中卻有較好的復(fù)制能力，表明H10N1 亞型AIV 仍有感染人的風(fēng)險(xiǎn)[11]。

H10 亞型AIV 偶爾感染家禽，帶毒家禽一般呈隱性感染不發(fā)病[12-13]，研究表明禽源 H10N8 亞型AIV 與H7N9、H9N2 等亞型基因重組后能夠提高病毒結(jié)合哺乳動(dòng)物 α-2，6 受體的結(jié)合能力[6,14]，本實(shí)驗(yàn)中分離株 HuN/78/15 的HA 基因與 2013年人感染的H10N8 的HA 基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但其它基因與H5、H7、H3 等多種亞型的 AIV 的相應(yīng)基因同源性非常高，因此不排除其造成流行的可能。

在對(duì)我國(guó)南方地區(qū)的AIV 持續(xù)監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，家鴨中 LPAIV 分離率比較高，往往多種 LPAIV 存在混合感染的情況，本實(shí)驗(yàn)分離株 HuN/78/15 的內(nèi)部基因與多種亞型LPAIV 的同源性較高，可能與多病毒混合感染有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì) HuN/78/15 的遺傳演化分析顯示，分離株的HA、NA 和NS 基因與越南、日本等一些周邊國(guó)家的鴨源分離株有相似的進(jìn)化來(lái)源，野鳥(niǎo)的遷徙活動(dòng)對(duì)病毒的傳播可能起到了一定的作用。