王 冰

(黑龍江農(nóng)墾職業(yè)學院，黑龍江 哈爾濱 151025)

赤羽病又名阿卡斑病(Akababe disease)，是由布尼病毒科、布尼病毒屬、辛波病毒群的赤羽病病毒(Akabane virus，AKAV)所引起的牛、綿羊和山羊的一種多形性傳染病，以牛、羊的流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)及先天性關節(jié)彎曲和積水性無腦癥(Arthrogryposis Hydraencephaly，AH 綜合癥)為特征[1-2]。該病首次于1949年在日本群馬縣赤羽村發(fā)現(xiàn)，1959年才首次從該地采集的金色庫蚊和三帶緣庫蚊體內(nèi)分離到病毒，因此命名為 AKAV，此后澳大利亞、肯尼亞、南非、以色列、日本等地相繼暴發(fā)該病[2-3]。我國科學家自1994年開始進行該病流行病學調(diào)查，至今已證實陜西、內(nèi)蒙、湖南、河北、北京、上海、山東、安徽、吉林、甘肅、江蘇、浙江、福建、湖北、廣東等部分地區(qū)均有該病的流行[1]。目前，已經(jīng)證實赤羽病廣泛分布于澳大利亞、東南亞、亞洲東部、中東和非洲的熱帶和溫帶地區(qū)，主要由蚊蟲、庫蠓、螨類等節(jié)肢動物傳播[1-3]。該病在我國被列為二類動物傳染病，為重點檢疫對象[3]。

AKAV 為單鏈負股RNA 病毒，其基因組由L(6 868 nt)、M (4 309 nt)、S (858 nt)3 個基因節(jié)段組成，分別編碼 RNA 依賴的 RNA 聚合酶 L(L 節(jié)段)、囊膜糖蛋白 G1、G2、NSm (M 節(jié)段)和核衣殼蛋白 N、NSs (S 節(jié)段)[4]。N 蛋白作為補體結(jié)合反應的抗原，可以直接與體外轉(zhuǎn)錄的病毒S 節(jié)段RNA 結(jié)合以及與被感染細胞的細胞器結(jié)合而調(diào)節(jié)病毒的復制等特性[5-6]。N 蛋白為 AKAV 核蛋白，約 27 ku，氨基酸序列分析顯示不同病毒株間N 蛋白相似性為97 %～100 %[6]。此外研究證實N 蛋白在病毒粒子與感染細胞中含量較多，可以作為診斷方法研究的有效靶抗原[6]。本實驗利用原核表達系統(tǒng)表達、純化AKAV N 蛋白并用其免疫小鼠制備單克隆抗體(MAb)，為AKAV 檢測方法的建立以及相關功能的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料SP2/0細胞、BHK-21細胞、藍舌病病毒1型(Bluetongue virus，BTV)、茨城病毒(Ibaraki virus，IBAV)、中山病病毒(Chuzan virus，CV)以及赤羽病病毒均由本實驗室保存；E.coliDH5α 與BL21 感受態(tài)細胞購自北京中衫金橋生物技術有限公司。6 周齡 SPF 級 BALB/c 雌鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。ExTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Marker 均購自 TaKaRa公司；T4 DNA連接酶、HRP標記的抗His標簽MAb購自NEB公司；MAb亞型鑒定試劑盒購自 Invitrogen 公司；預染蛋白Marker購自Fermentas公司；DAB顯色試劑盒、HRP標記的山羊抗鼠IgG(IgG-HRP)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、羊抗鼠 IgG-FTTC 均購自 Gibco 公司；弗氏佐劑、PEG、HAT、HT 和 8- 氮鳥嘌呤(8-AG)、TMB 底物均購自 Sigma 公司；IPTG 購自 Merck 公司；TRIzol試劑與質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自Axygen 公司；膠回收小量試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。

1.2 AKAV N 蛋白的原核表達與純化 根據(jù)Gen-Bank 中登錄的 AKAN N 基因序列(AB000851)，利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。其序列如下：F：5'-GG CGGTACCATGGCAAATCAATTCATTTTCAACGA T-3'；R：5'-GCCGTCGACGGATCTGGATACCAAAT TGAGCCAGG-3'。利用 TRIzol 試劑從 AKAV 感染的BHK-21 細胞中提取病毒基因組RNA，利用下游引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后作為模板，利用上述特異性引物對N 基因進行PCR 擴增。膠回收目的片段克隆至 pET-30a 中，構(gòu)建原核表達載體 pET-N，經(jīng)PCR 和雙酶切鑒定正確后由上海英駿公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 感受態(tài)細胞，利用IPTG 誘導表達。收集的菌液離心，收獲細菌沉淀。經(jīng) SDS-PAGE 電泳檢測 N 蛋白的表達。以 HRP 標記的抗 His 標簽的 MAb (1∶2 000)為檢測抗體，采用western blot 鑒定N 蛋白及其生物學活性。表達的重組N 蛋白利用包涵體純化方法純化并檢測純化效果。

1.3 動物免疫 以純化的重組N 蛋白經(jīng)腹腔注射免疫6周齡 BALB/c 雌鼠6只，劑量約為 100 μg/只，每兩周免疫一次。首免將重組N 蛋白與弗氏完全佐劑混合，二免和三免將重組N 蛋白與弗氏不完全佐劑混合，三免后一周尾靜脈采血，將血清倍比稀釋采用間接ELISA 檢測血清抗體效價[7]，選擇血清效價最高的小鼠于融合前 3 d 以 100 μg N 蛋白(不加佐劑)加強免疫，取其脾細胞進行細胞融合。

1.4 AKAV N 蛋白抗體間接ELISA 檢測方法的建立按常規(guī)間接 ELISA 操作步驟[7]，用 ELISA 包被緩沖液對重組N 蛋白做倍比稀釋，經(jīng)方陣法確定最佳檢測條件。

1.5 分泌MAb 的雜交瘤細胞株的制備、效價及亞類的測定 在融合前24 h 制備飼養(yǎng)層細胞用于細胞融合，將SP2/0 細胞與效價最高的小鼠脾細胞以1:4混合，加入PEG-6000 融合后經(jīng)選擇性培養(yǎng)基HAT、HT 進行培養(yǎng)[6]。待雜交瘤細胞生長至板底面積1/4～1/3 或培養(yǎng)液變微黃色后，通過建立的間接ELISA 方法篩選陽性雜交瘤細胞株，同時將SP2/0細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照。選擇陽性雜交瘤細胞進行亞克隆，直到篩選出穩(wěn)定分泌特異性MAb 的雜交瘤細胞株進行擴大培養(yǎng)，并將細胞凍存。

選取10 周齡的BABL/c 小鼠腹腔注射滅菌液體石蠟，7 d 后腹腔注射雜交瘤細胞，待小鼠腹部膨大收集腹水。MAb 上清分別作21～28倍稀釋及腹水分別作101～108倍稀釋作為一抗，同時設立陰陽性血清對照，通過1.4 建立的間接ELISA 法測定其效價。采用MAb 亞型鑒定試劑盒進行其亞類鑒定。

1.6 MAb 的鑒定

1.6.1 MAb 特異性的鑒定 將 AKAV、BTV1、IBAV、CV 分別接種于 BHK-21 細胞，培養(yǎng) 24 h 后用預冷的 75 %乙醇 4 ℃固定 30 min，以 MAb 上清(1∶2)為一抗，以羊抗鼠 IgG-FITC (1∶50)為二抗，同時設立未接病毒的細胞為空白對照及陰、陽性血清對照，間接免疫熒光(FFA)檢測MAb 的特異性。

1.6.2 MAb 的 western blot 鑒定 將 AKAV 接種BHK-21 細胞，待其完全病變后收集細胞沉淀，同時收集未接毒BHK-21 細胞沉淀、大腸桿菌沉淀，常規(guī)處理后，同時將 1.2 原核表達的N 蛋白，一并進行 SDS-PAGE 電泳。分別以 MAb 上清(1∶2)作為一抗，羊抗鼠 IgG-HRP (1∶5 000)作為二抗，經(jīng) western blot 分析MAb 的反應性。

1.6.3 雜交瘤細胞的穩(wěn)定性檢測 將凍存3 個月的雜交瘤細胞復蘇連續(xù)多次傳代(20 代)，以1.4 建立的間接ELISA 方法檢測每代雜交瘤細胞上清的抗體效價，評價其分泌抗體的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 AKAV 重組N 蛋白的表達及純化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-N 經(jīng)PCR 和雙酶切鑒定正確后利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達AKAV 重組N 蛋白，通過包涵體純化方法對其進行了純化并檢測。SDS-PAGE 結(jié)果顯示，重組N 蛋白得到表達且純化效果較好，在35 ku 處出現(xiàn)目的條帶，與預期相符(圖1A)。Western blot 結(jié)果顯示該蛋白可以與抗His MAb 反應，在35 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，而空載體表達產(chǎn)物不與抗His MAb 反應(圖1B)。表明重組 N 蛋白得到了表達，且具有較好的反應性。

2.2 檢測AKAV N 蛋白抗體的間接ELISA 方法的建立 經(jīng)方陣法優(yōu)比間接ELISA 最佳反應條件為：N 蛋白 1∶500 稀釋即每孔約為 100 ng，5%脫脂乳4℃封閉過夜，陰陽性血清1∶2 000稀釋，山羊抗鼠HRP-IgG 工作濃度 1∶5 000 時，作用條件均為 37 ℃孵育1 h，底物顯色時間為10 min，可用于陽性雜交瘤細胞的篩選。

圖1 重組N 蛋白的SDS-PAGE (A)和western blot 分析 (B)Fig.1 Analysis of recombinant N protein by SDS-PAGE (A)and western blot (B)

2.3 MAb 的制備及效價與亞類的鑒定 免疫的BALB/c 小鼠脾細胞與SP2/0 細胞融合后，經(jīng)建立的間接ELISA 法篩選為陽性的雜交瘤細胞經(jīng)3 次細胞亞克隆純化后，得到1 株穩(wěn)定分泌抗AKAV N 蛋白MAb 的陽性雜交瘤細胞，命名為IIG5。經(jīng)建立的間接ELISA 測定MAb IIG5 雜交瘤細胞上清的效價為1∶2 562，腹水效價為 1∶105。IIG5 亞類為 IgG1/κ 鏈。

2.4 MAb 的鑒定

2.4.1 MAb 特異性的鑒定 分別用IIG5 MAb培養(yǎng)上清液對接種BTV1、IBAV、CV 和 AKAV 的BHK-21 細胞及未接種病毒的BHK-21 細胞進行IFA檢測，結(jié)果顯示 IIG5 僅與 AKAV 發(fā)生陽性反應，與其它病毒呈陰性反應(圖2)。表明，MAb IIG5 具有良好的特異性。

圖2 MAb 特異性的鑒定結(jié)果Fig.2 Specific identification of the MAbs by IFA

2.4.2 MAb 的 western blot 鑒定 將 IIG5 MAbs 的培養(yǎng)上清經(jīng)western blot 鑒定，結(jié)果顯示 IIG5 細胞上清與原核表達的N 蛋白、AKAV 感染的細胞沉淀中的 N 蛋白均呈陽性反應，分別于35 ku 與 27 ku處出現(xiàn)特異性條帶，而與大腸桿菌菌體蛋白以及BHK-21 細胞蛋白呈陰性反應(圖3)，表明，IIG5 與原核表達的N 蛋白以及病毒感染細胞中的N 蛋白均具有較好的反應性。

圖3 IIG5 MAb 的 western blot 鑒定Fig.3 Identification of the MAb by western blot

2.4.3 雜交瘤細胞的穩(wěn)定性檢測 將凍存3 個月的IIG5 雜交瘤細胞復蘇后，連續(xù)傳20 代收集每代培養(yǎng)上清進行間接ELISA 檢測，結(jié)果顯示每代IIG5 細胞株均能夠分泌特異性的MAb，且分泌的MAb 效價無明顯變化(數(shù)據(jù)未提供)。表明該細胞株能夠穩(wěn)定分泌特異性MAb。

N 蛋白是AKAV 的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒粒子以及感染細胞中含量較高且具有較好的免疫原性，此外該基因在AKAV 各分離株間較保守，是一個適用于建立型特異性檢測方法的抗原，利用其所制備的MAb 也具有一定的應用價值[8]。本實驗基于此開展研究，利用 PCR 擴增本實驗室保存的 AKAV N 蛋白基因，構(gòu)建表達載體，利用原核表達系統(tǒng)表達N蛋白，經(jīng)過融合以及3 輪篩選后獲得一株雜交瘤細胞株IIG5，且該細胞株能夠穩(wěn)定分泌特異性的MAb，該 MAb 的制備為 AKAV 檢測及其它相關研究奠定基礎。