姜志剛，徐和敏，邵 葳，潘春剛，于 力*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 牛羊傳染病研究創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069；2.中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100070)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是具有異質(zhì)性特征的革蘭氏陰性病原菌群，一般寄生于家養(yǎng)和野生動物的上呼吸道，具有條件致病性，在某些應(yīng)激條件刺激下，可以引起帶菌動物發(fā)生以敗血和/ 或呼吸系統(tǒng)疾患為主的疾病[1]。根據(jù)莢膜抗原的特異性，可將 Pm 分為 A、B、D、E 和 F 等 5個莢膜型[2]。莢膜 A 型和莢膜 B 型 Pm 是引起我國牛巴氏桿菌病的病原。其中莢膜B 型Pm 引起的牛出血性敗血癥是牛的重要疫病[3]，牛莢膜A 型 Pm是2008年首次被分離鑒定的引起牛纖維素性化膿性肺炎的新病原[4-8]，是近10年來嚴重危害我國養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的新發(fā)疫情[7]。由于Pm 不同血清型之間的交叉保護力差[3]，現(xiàn)有的牛出血性敗血癥滅活疫苗(莢膜B 型Pm 單價苗)不能有效防控莢膜A 型Pm 引起的牛纖維素性化膿性肺炎。因此，研發(fā)針對莢膜A 型Pm 的滅活疫苗是必要而緊迫的。

本研究團隊前期研究已經(jīng)確定了牛莢膜A 型Pm 與牛纖維素性化膿性肺炎因果關(guān)系[7]，并且建立了莢膜 A 型 Pm 的牛體免疫攻毒模型[8]；同時，參考現(xiàn)行的《 牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程》(莢膜 B 型 Pm 單價苗)[9]，重新測定了牛莢膜B 型疫苗菌株對牛的最小致死量(MLD)以及最小免疫劑量(未發(fā)表資料)。在上述研究的基礎(chǔ)上，本研究將毒力強、免疫原性好的牛莢膜A 型Pm-TJ株，與已商品化的牛莢膜B 型Pm 滅活苗生產(chǎn)用菌株C45-2 株(CVCC 44502)作為制苗菌種，制備牛莢膜Pm 病二價滅活疫苗，并對該制品的安全性、免疫效力、免疫持續(xù)期進行研究，為全面控制我國牛巴氏桿菌病提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌株、實驗動物與主要試劑 牛莢膜A 型Pm-TJ 株(簡稱 Pm-TJ 株)由哈爾濱獸醫(yī)研究所保存并提供；牛莢膜 B 型 Pm C45-2 株(簡稱 C45-2 株)由中牧蘭州生物藥廠保存并提供。體質(zhì)量為1.5 kg～2.0 kg 的家兔由中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠自繁自養(yǎng)；體質(zhì)量為 18 g～22 g SPF 級 BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；6月齡西門塔爾雜交肉牛(西雜牛)和3 歲齡荷斯坦奶牛分別來自重慶某肉牛場和甘肅某奶牛場。腦心浸液培養(yǎng)基和馬丁肉湯培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鋁膠佐劑由中牧蘭州生物藥廠配制。

1.2 Pm 二價滅活疫苗的制備 取Pm-TJ 株活化菌液按 2 %量接種于 BHI 培養(yǎng)基，置 37 ℃、75 r/min培養(yǎng) 8 h 后收獲；同時，取 C45-2 株活化接種于含0.1 %裂解血球全血的馬丁肉湯中，37 ℃培養(yǎng)12 h后收獲。對收獲的兩種菌液分別進行純粹性檢驗和活菌計數(shù)后離心濃縮，分別加入0.1 %甲醛溶液于37 ℃滅活12 h，滅活檢驗合格后將菌液與氫氧化鋁膠佐劑按5∶1 的比例混勻分別制成滅活疫苗，混合兩種滅活疫苗，使Pm-TJ 株和C45-2 株的終濃度分別為 1×1010cfu/mL 和 5.0×109cfu/mL，制備 Pm 二價滅活疫苗。

1.3 Pm 二價滅活疫苗的安全性試驗

1.3.1 非靶動物安全性試驗 將制備的Pm 二價滅活疫苗分別皮下接種10 只小鼠和10 只家兔，參考現(xiàn)行的 《 牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程》(莢膜 B 型 Pm 單價苗)，分別接種 0.3 mL/ 只和 4 mL/ 只[9]，同時設(shè)置相同數(shù)量的未接種動物作為對照，10 d 內(nèi)觀察動物的接種部位、精神狀態(tài)及存活情況。

1.3.2 靶動物安全性試驗 將制備的Pm 二價滅活疫苗分別以單劑量(2 mL/ 頭)、單劑量重復(fù)(間隔 2周)以及超劑量(4 mL/ 頭)經(jīng)肌肉途徑分別接種10 頭6月齡西雜牛以及3 歲齡10 頭荷斯坦奶牛，同時設(shè)置相同數(shù)量的未接種動物作為對照。于接種后每日測量動物體溫、觀察動物的接種部位和精神狀態(tài)，并記錄存活情況，觀察期為14 d。為評價疫苗對牛生產(chǎn)性能的影響，在觀察期內(nèi)每日記錄荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶量；于免疫前和免疫后30 d 測量西雜牛的體重，并計算月增重。

1.4 Pm 二價滅活疫苗對牛的免疫保護試驗 將24頭6月齡西雜牛隨機分為 3組，每組 8 頭，分別以每頭 2.0 mL、1.0 mL 和 0.5 mL 的 Pm 二價滅活疫苗頸部肌肉注射接種每組實驗牛，另設(shè)6 頭未接種疫苗牛作為對照組。接種后第21 d，隨機選擇各實驗組4 頭牛和對照組3 頭牛經(jīng)氣管接種Pm-TJ 強毒株(5.3×108cfu/ 頭)，每日觀察牛的臨床表現(xiàn)，于攻毒后第10 d 剖檢、記錄肺部病理變化，并進行細菌再分離及PCR 鑒定[7]。根據(jù)本團隊前期的病原菌回歸牛體致病試驗結(jié)果[7-8]，本研究對攻毒牛的臨床癥狀及病理變化打分評價該二價滅活疫苗對免疫牛的保護效果。各實驗組另4 頭牛與對照組另3 頭牛采用肌肉注射 C45-2 強毒株(5.2×106cfu/ 頭)[9]攻毒，觀察14日。參照 《 牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程》(莢膜 B 型 Pm 單價苗)[9]，本研究將二價滅活疫苗免疫效力的標準確定為：若攻毒后對照組牛全部(3/3)發(fā)病(A 型菌攻毒)或死亡(B 型菌攻毒)時，免疫牛應(yīng)至少3/4 獲得保護；若攻毒后對照牛2/3 發(fā)病或死亡，免疫牛應(yīng)全部(4/4)獲得保護。根據(jù)攻毒后牛的存活情況評價疫苗接種對攻毒牛的保護效果。

1.5 Pm 二價滅活疫苗接種牛免疫持續(xù)期的測定將Pm 二價滅活疫苗肌肉接種32 頭西雜牛，2.0 mL/頭，同時設(shè)24 頭未免疫牛作為對照。在免疫后3、6、9 和 10 個月，分別對免疫牛和對照牛攻毒。即在每個攻毒時間點隨機挑選4 頭免疫牛和3 頭對照牛攻擊A 型菌Pm-TJ 株，另隨機挑選4 頭免疫牛和3 頭對照牛攻擊B 型菌C45-2 株攻毒，攻毒方法同1.4。統(tǒng)計每個時間點的攻毒保護結(jié)果，確定該疫苗的免疫持續(xù)期。

2 結(jié) 果

2.1 二價滅活疫苗安全性試驗結(jié)果 將制備的Pm二價滅活疫苗皮下接種非靶動物小鼠和兔，觀察期內(nèi)接種動物均健活，未出現(xiàn)精神萎靡以及接種部位紅腫、結(jié)節(jié)等不良反應(yīng)，與未接種動物無可見差異。將疫苗分別以單劑量、單劑量重復(fù)以及超劑量接種西雜肉牛及荷斯坦奶牛。觀察期內(nèi)所有接種牛均健活，未出現(xiàn)體溫升高、精神萎靡以及接種部位紅腫、結(jié)節(jié)等不良反應(yīng)，與對照牛無可見差異。此外，本研究還通過測量6月齡肉犢牛月增重以及3歲泌乳牛日產(chǎn)奶量來評價疫苗對免疫牛生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果顯示，將疫苗以一次單劑量、單劑量重復(fù)以及一次超劑量免疫肉犢牛后，犢牛在首免后30 d內(nèi)平均月增重分別為 17.0 kg、16.3 kg、17.1 kg，對照組犢牛平均月增重為16.7 kg (圖1A)，免疫組與對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(t 檢驗，p＞0.05)；采用該3 種方式接種泌乳牛，14 d 內(nèi)觀察每日產(chǎn)奶量，方差分析顯示免疫組與對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05) (圖1B)。上述結(jié)果表明，制備的牛 Pm 病二價滅活疫苗具有良好的安全性。

圖1 接種二價滅活疫苗對牛生產(chǎn)性能的影響Fig.1 Effect of the bivalent inactivated vaccine inoculation on production performance of cattle

2.2 二價滅活疫苗對牛的免疫保護試驗結(jié)果 將二價滅活疫苗分別以每頭2.0 mL、1.0 mL 和 0.5 mL的劑量經(jīng)頸部肌肉途徑接種實驗牛，于免疫后21 d分別以 Pm-TJ 株和 C45-2 株強毒攻擊，結(jié)果顯示，當(dāng)免疫劑量為2 mL/ 頭時，免疫犢牛無論用A 型菌還是B 型菌攻毒，保護率均能達到100 % (4/4)；當(dāng)免疫劑量降低至1 mL/ 頭時，免疫犢牛用A 型菌攻毒后的保護率可達75 % (3/4)，用B 型菌攻毒后的保護率仍能夠達到 100 % (4/4)；用 0.5 mL 疫苗免疫犢牛后，其對A 型和B 型菌攻毒后的保護率均為25%(1/4)；未免疫的對照犢牛用A 型菌攻毒后100%(3/3)發(fā)生纖維素性化膿性肺炎，用 B 型菌攻毒后100 % (3/3)發(fā)生牛出血性敗血癥而死亡，結(jié)果詳見表1。表明二價滅活疫苗能夠同時保護對莢膜A 型和B 型Pm 的攻擊產(chǎn)生有效的免疫保護，且最小免疫劑量為1 mL/ 頭份。

表1 二價滅活疫苗對犢牛免疫效力的評價Table 1 Evaluation of immune potency of the bivalent inactivated vaccine for calves

2.3 二價滅活疫苗對牛的免疫持續(xù)期測定結(jié)果 將本研究疫苗制品按推薦劑量(2 mL/ 頭份)接種西雜牛，在接種疫苗后分別于不同時段采用A 型Pm-TJ株和 B 型C45-2 株對免疫牛進行攻擊，結(jié)果顯示，實驗牛在免疫后各時段對A 型菌和B 型菌的攻毒保護率均能夠達到75 % (3/4)及以上(表2)，符合免疫效力標準。表明該二價滅活疫苗免疫10 個月內(nèi)能夠同時對A 型菌和B 型菌的攻擊提供有效保護，疫苗免疫持續(xù)期至少10 個月。

表2 二價滅活疫苗對犢牛免疫持續(xù)期的測定Table 2 Immune duration of the bivalent inactivated vaccine-inoculated calves

3 討 論

本研究按照獸用新生物制品研制的要求，對制備的牛 Pm A 型 Pm-TJ 株和 B 型 Pm C45-2 株二價滅活疫苗開展了安全性和免疫效力的研究，為該疫苗產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化研發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)。

在疫苗研究中，用非靶動物替代本動物進行安全性檢驗，在保證疫苗安全檢驗要求的前提下，可以減少本動物安全性檢驗中牛的使用，這不僅符合動物倫理方面的要求，同時也可以降低批次檢驗的成本。在現(xiàn)行《 牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程》[9](莢膜B 型Pm 單價苗)的安全性檢驗中，小鼠和兔均采用皮下注射，小鼠接種劑量為0.3 mL，兔接種劑量為本動物的1 倍劑量，即5.0 mL；本制品采用了小鼠安全檢驗的方法，而用兔檢驗時接種劑量提高至本動物使用劑量的2 倍，即4.0 mL(本制品為濃縮苗，本動物推薦使用劑量為2 mL)，因此本研究中的安全性檢驗標準更高、結(jié)果更加可靠。

在本動物牛的安全性和免疫效力研究中，接種劑量以及攻毒劑量的確定，是依據(jù)前期研究中建立的莢膜A 型Pm 免疫攻毒模型結(jié)果[8]，以及中牧蘭州生物藥廠對莢膜B 型Pm 的毒力與免疫原性重新測定的結(jié)果(未發(fā)表資料)。在攻毒試驗中，用莢膜A 型和莢膜B 型Pm 攻擊時采用不同的標準判定結(jié)果，這是由于兩種血清型細菌對牛的致病性明顯不同。B 型菌侵入牛體形成敗血癥，引起全身性多系統(tǒng)病理變化導(dǎo)致其急性死亡，因此建立攻毒模型是以牛死亡作為判定指標，效力試驗依然參照現(xiàn)行的《 牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程》[9](B 型 Pm 單苗)操作。與之明顯不同的是，莢膜 A型Pm 人工感染牛所引起的病理變化局限在肺臟，呈現(xiàn)纖維素性化膿性肺炎，無全身性病理變化，在無明顯應(yīng)激因素刺激時，多數(shù)牛呈現(xiàn)亞急性或慢性發(fā)病，短期內(nèi)不會引起死亡，因此建立攻毒模型是以臨床癥狀、病理變化結(jié)合實驗室檢測對發(fā)病牛進行判定[7-8]。免疫后攻毒結(jié)果顯示，接種二價滅活疫苗可使?fàn)倥Ｍ瑫r抵抗莢膜 A 型 Pm 和莢膜B 型 Pm的攻擊，其最小免疫劑量為1 mL。然而，考慮到牛莢膜A 型Pm 屬于典型的條件致病性病原，現(xiàn)地牛背景復(fù)雜而且易受多種應(yīng)激因素的影響，為保證疫苗的免疫效果，在實際應(yīng)用中將接種劑量定為2 mL/ 頭。

在免疫持續(xù)期的研究中，考慮到現(xiàn)有牛Pm 病滅活疫苗(莢膜B 型Pm 單價苗)產(chǎn)品的免疫持續(xù)期為9 個月，本研究將持續(xù)期試驗的攻毒時間節(jié)點定為 3、6、9、10 個月。結(jié)果顯示，犢牛接種疫苗后10 個月仍能夠同時抵抗 A 型和B 型Pm 的攻擊，可見該疫苗免疫持續(xù)期至少可達到10 個月，這也與預(yù)期相符。然而，考慮到牛群中其它病原混合感染等應(yīng)激因素，為保證牛持續(xù)處于最佳免疫狀態(tài)，在實際應(yīng)用時，二價滅活疫苗的免疫持續(xù)期定為9 個月。

綜上所述，本研究在前期建立的莢膜A 型Pm免疫攻毒模型的基礎(chǔ)上，聯(lián)合A 型和B 型Pm 菌株研制牛Pm 病二價滅活疫苗，該二價疫苗對牛安全、有效，可以同時預(yù)防牛纖維素性化膿性肺炎和牛出血性敗血癥，該疫苗將對全面有效地控制我國的牛多Pm 病疫情具有重要價值。