雷先會，趙蔚萍，楊 森

熱休克蛋白60（HSP60）為細菌的主要抗原，其作用機制尚不明確?？赡苁峭ㄟ^介導細菌附著于上皮細胞，刺激宿主免疫反應[1]，進而誘導感染。研究表明，由耶爾森氏菌和幽門螺桿菌純化而來的HSP60可誘導人胃黏膜上皮細胞分泌IL-8，但大腸桿菌純化得到的HSP60卻不能[2]。因此，HSP60的作用機制似乎與其細菌來源密不可分。放線共生放線桿菌（Aa）是重要牙周致病菌，可擾亂宿主免疫防御系統(tǒng)[3]。國外研究報道，Aa可侵入人口腔頰黏膜上皮細胞[4]。鄒博等[5]采用熒光原位雜交技術和激光共聚焦掃描顯微鏡檢測到，在頰黏膜上皮細胞內(nèi)，Aa占全細菌的相對比例為60%～100%，提示Aa可在口腔黏膜上皮內(nèi)定植，是口腔黏膜病的主要致病菌。本研究從Aa中提取并純化HSP60的細菌同源物GroEL（AaGroEL），研究其對OMECs增殖的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 AaGroEL的純化 采用ATP-瓊脂糖親和層析及SDS-PAGE凝膠電泳，從Aa（ATCC公司）中提取并純化AaGroEL[6]。

1.2 OMECs分離培養(yǎng)及干預 收集15名正常牙周健康者的口腔黏膜，其中男性7名，女性8名。口腔黏膜經(jīng)PBS反復洗滌后，去除黏膜下組織，浸入2.5 g/L的中性蛋白酶中，4℃消化18 h。然后撕下上皮層，置入 0.25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA（1∶1）的混合消化液中，37℃振蕩消化10 min；再加入10%胎牛血清終止消化，用吸管吹打制備成單細胞懸液，接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng)。當OMECs細胞匯合度達到80%以上時，轉(zhuǎn)入無血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。 然后加入 0.25 g/ml的 AaGroEL（HSP60組），對照組則加入溶媒。

1.3 細胞增殖率檢測 將上述兩組細胞以1×103的密度接種于96孔板，5%CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng)。分別于培養(yǎng) 0、6、12、24、48、72、96、144 h 時， 加入10 μl的 CellTiter 96?Aqueous溶液（美國Promega公司），37℃避光孵育4 h，采用酶標儀在490 nm處檢測吸光度，計算細胞增殖抑制率。每次做4個平行試驗，重復3次。細胞增殖抑制率=（1－HSP60組吸光度/對照組吸光度）×100%。

1.4 實時定量PCR檢測 取與AaGroEL孵育12 h和96 h的OMECs，采用實時定量PCR法，檢測細胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)激酶（ER K）、絲裂原激活蛋白激酶p38（p38）、蛋白磷酸酶 1（PP1）基因的表達水平。

此外，將OMECs隨機分為對照組、Heat組和Heat+HSP60組。分別以1×103個細胞/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，將Heat組和Heat+HSP60組置于45℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min；對照組置于37℃的細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。之后再向Heat+HSP60組中加入0.25 μg/ml的AaGroEL，對照組和Heat組加入溶媒，于37℃孵育12 h。采用實時定量PCR檢測3組細胞中HSP60和HSP70的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用One-way ANOVA，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AaGroEL對OMECs增殖的影響 與對照組比較，在孵育12 h前，AaGroEL促進OMECs的增殖；而在孵育12 h后，AaGroEL對OMECs的增殖有顯著的抑制作用。見圖1。

圖1 AaGroEL對口腔上皮細胞增殖的影響

2.2 AaGroEL對MAPKs相關分子基因的影響與對照組比較，孵育12 h時，AaGroEL顯著增加ER K1和ER K2的表達，均抑制p38和PP1的表達（P<0.05）；孵育 96 h 時，AaGroEL 顯著降低 ER K1和ER K2的表達，均增加p38和PP1的表達（P<0.05）。 見表 1。

表1 MAPK信號通路中各信號分子mRNA的相對表達

2.3 AaGroEL抑制細胞內(nèi)HSP60的表達 與對照組比較，Heat組HSP60和HSP70的表達均顯著增加（P<0.05）；而Heat+HSP60組HSP60與對照組無顯著差異，HSP70與Heat組比較無顯著差異（P>0.05）。 見表 2。

表2 AaGroEL對細胞內(nèi)HSP60表達的影響

3 討論

熱休克蛋白(HSPs)是一類高度保守的應激蛋白，作為“分子伴侶”保護蛋白免于高溫損傷。HSP60是一種線粒體伴侶蛋白，通常負責蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)向線粒體基質(zhì)的轉(zhuǎn)運和重折疊[7]。HSP60細菌同源物GroEL已得到廣泛研究，將HSP60與糖尿病、應激反應、癌癥和某些免疫疾病聯(lián)系起來[7]。

研究表明，用從Aa中純化AaGroEL刺激上皮細胞48 h，可顯著促進其增殖[8]。但本研究發(fā)現(xiàn)，在孵育12 h前，AaGroEL促進OMECs的增殖；而在孵育12 h后，AaGroEL對OMECs的增殖有顯著的抑制作用。提示AaGroEL短期孵育可促進OMECs的增殖，但只要達到一定的孵育時間后，卻轉(zhuǎn)而抑制OMECs的增殖。因此推斷，長期細菌感染可抑制OMECs的增殖，此為口腔潰瘍形成的可能機制。

為探究HSP60對OMECs增殖長期和短期影響不同的原因，本課題檢測AaGroEL孵育12 h和96 h后MAPKs相關分子ERK以及細胞死亡標志物p38表達的變化。結(jié)果表明，AaGroEL短期孵育可促進ERK1/2的表達，而長期孵育可促進p38的表達。由于ERK1/2與細胞增殖和存活有關，而p38激活誘導細胞死亡。提示AaGroEL短期孵育可促進OMECs的增殖，長期孵育則誘導細胞死亡，AaGroEL短期孵育誘導OMECs增殖的原因可能與激活ERK1/2有關。PP1表達的變化進一步證實了這一點，因為MAPKs的激活受蛋白磷酸酶（PP）的調(diào)控，PP激活可使MAPKs去磷酸化而喪失活性。PP1為絲/蘇氨酸磷酸酶和多種激酶（包括蛋白激酶 Cα、Akt、Bcl2、Src和 ERK）的抑制劑[9]。因此，AaGroEL短期孵育時PP1的表達降低，ERK1/2激活，促進OMECs增殖。AaGroEL長期孵育抑制OMECs增殖的原因可能與p38表達的增加有關，而且此時PP1的表達也增加，ERK1/2去磷酸化，MAPKs受阻，OMECs增殖抑制。

細胞內(nèi)HSP60在細胞應激損傷時起保護作用。Ranford等[10]的研究顯示，當細胞暴露于HSP60的細菌同源物（GroEL）時，可誘導宿主細胞產(chǎn)生大量抗體，而這些抗體可與人HSP60蛋白交叉反應。也就是說，AaGroEL可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生HSP60抗體，即便細菌和人類HSP60具有不同的蛋白質(zhì)序列，但這些抗體依舊可以識別并攻擊人胞內(nèi)HSP60，降低HSP60誘導口腔黏膜病病灶惡化的生物學作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，AaGroEL孵育12 h可顯著抑制熱刺激誘導的胞內(nèi)HSP60表達的增加，但對熱刺激誘導的HSP70表達無顯著影響，證實與AaGroEL短期孵育，可導致細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的HSP60抗體。

總之，AaGroEL短期處理促進OMECs增殖，而長期處理則抑制OMECs增殖，其機制可能與AaGroEL雙調(diào)控MAPK信號通路有關。