尹玲倩，冉金山，李菁菁，任鵬，張賢嫻，劉益平

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禽類就巢性狀的遺傳調(diào)控

尹玲倩，冉金山，李菁菁，任鵬，張賢嫻，劉益平

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130

就巢在家養(yǎng)禽類中普遍存在，主要表現(xiàn)為食欲減退、停止產(chǎn)蛋并開始孵化等行為變化。此外，就巢期禽類的卵巢及輸卵管的生理形態(tài)也會發(fā)生顯著的變化。禽類就巢性是一種由常染色體上的多基因控制的低遺傳力性狀，主要受環(huán)境因素、內(nèi)分泌因素和遺傳因素的影響。就巢性的研究最初開始于對禽類就巢行為特征的觀測，隨著技術(shù)的發(fā)展，逐漸深入到禽類就巢性的遺傳方式、內(nèi)分泌因素、就巢性候選基因及其多態(tài)性的研究。近幾年隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和多組學(xué)聯(lián)合分析來篩選與禽類就巢性相關(guān)的候選基因和信號通路，同時調(diào)控禽類就巢性的分子機(jī)制也逐漸被揭示。本文從不同層面對調(diào)控禽類就巢性的基因、microRNAs和信號通路進(jìn)行了綜述，以期為后續(xù)探究禽類就巢性的具體分子機(jī)制提供參考。

家禽；就巢性；繁殖激素；候選基因；microRNA；信號通路

同大多數(shù)脊椎動物相比，禽類具有一種典型的繁殖特征，即就巢性。就巢行為是禽類為適應(yīng)多變的環(huán)境，在漫長的自然選擇中形成的一種利于繁衍后代和擴(kuò)大群體規(guī)模的本能行為。這種行為主要表現(xiàn)在母禽進(jìn)入產(chǎn)蛋窩巢的次數(shù)增加，同時伴隨著停留時間延長，最終停止產(chǎn)卵而進(jìn)行孵化。如果禽類長期處于典型就巢狀態(tài)，會引起輸卵管和卵巢發(fā)生萎縮，嚴(yán)重降低產(chǎn)蛋量甚至休產(chǎn)。姜潤深等[1]根據(jù)雞就巢時間和臥息時間長短，將雞的就巢行為分為3種類型，即非就巢型、非典型就巢型和典型就巢型。影響禽類就巢的因素主要分為環(huán)境因素、內(nèi)分泌因素和遺傳因素。環(huán)境因素中光照和溫度對就巢行為的影響較大，陰暗和高溫環(huán)境會誘導(dǎo)禽類產(chǎn)生就巢行為。繁殖激素等內(nèi)分泌因子直接參與禽類就巢性的調(diào)控，其中催乳素(prolactin, PRL)是引起和維持家禽就巢行為的主要激素。遺傳因素是導(dǎo)致禽類產(chǎn)生就巢性的根本原因，對于就巢性的遺傳規(guī)律有多種解釋，但最終證實控制就巢性的基因位于常染色體上，其中有研究推測白來航雞基因啟動 子中的一段24 bp的純合插入序列可能會影響白來航雞體內(nèi)的表達(dá)，進(jìn)而影響白來航母雞的就 巢性[2,3]。

與產(chǎn)蛋期母禽相比，就巢期母禽的繁殖行為和生殖系統(tǒng)的形態(tài)都發(fā)生了顯著變化。就巢期間禽類的卵巢出現(xiàn)了嚴(yán)重的萎縮與退化，無等級卵泡發(fā)育或極少數(shù)發(fā)育的等級卵泡停止發(fā)育并出現(xiàn)閉鎖，卵泡中顆粒細(xì)胞層和膜細(xì)胞顯著減少[4~7]。深入研究發(fā)現(xiàn)，造成就巢期禽類卵巢形態(tài)發(fā)生改變的直接原因是由于禽類體內(nèi)的內(nèi)分泌激素的含量發(fā)生改變，其中主要是繁殖激素含量的改變。通過對就巢期禽類血清中的繁殖激素進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)處于就巢期的雞、鴨、鵝和火雞()的血清中PRL含量顯著高于產(chǎn)蛋期[5,8,9]。此外，雌二醇(estradiol, E2)、孕激素(progesterone, P4)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)和促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)等繁殖激素同樣也被證實參與禽類就巢性的調(diào)控[10,11]。除繁殖激素外，許多神經(jīng)內(nèi)分泌因子，如催乳素釋放因子血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)[12]、多巴胺(dopamine, DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HA)[13,14]等，也能夠通過影響PRL的合成與釋放間接調(diào)控禽類的就巢行為。

盡管通過主動、被動免疫和環(huán)境調(diào)控可以在一定程度上降低就巢行為的發(fā)生率，但這種方法并不適用于現(xiàn)代化大規(guī)模的禽業(yè)生產(chǎn)。因此，從根本上消除禽類的就巢性是目前亟待解決的問題。開展就巢性相關(guān)候選基因的研究有助于確定控制就巢性狀的主效基因，深入了解就巢性的遺傳基礎(chǔ)和具體的分子機(jī)制，最終通過遺傳育種的方法培育無就巢性的禽類品種，以此來提高家禽的繁殖性能。近幾年在環(huán)境和內(nèi)分泌研究的基礎(chǔ)上，研究人員從分子層面進(jìn)一步揭示了調(diào)控禽類就巢性的因素，并對抑制或消除就巢性的方法進(jìn)行探索。本文根據(jù)前人對禽類就巢性的研究，對參與調(diào)控禽類就巢性的基因、miRNA和信號通路進(jìn)行了綜述。

1 參與就巢性調(diào)控的基因

1.1 繁殖激素相關(guān)基因

生殖激素含量的變化是誘導(dǎo)禽類產(chǎn)生就巢性的直接原因。最初，研究主要集中于、和等繁殖激素相關(guān)基因的表達(dá)和多態(tài)性的分析。Jiang等[2]在探究綠殼蛋雞中和基因的變異對繁殖性狀的影響時發(fā)現(xiàn)，基因啟動子區(qū)域的PRLpro2位點的插入/缺失突變對平養(yǎng)綠殼蛋雞的就巢性有顯著的影響。朱盼[15]利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了在4個時期中皖西白鵝垂體、下丘腦、卵巢3個組織中基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)基因在就巢期的表達(dá)量最高，且在就巢前期的表達(dá)量達(dá)到最大，卵巢中基因的表達(dá)水平顯著高于下丘腦和垂體。但是，段修軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)在就巢期的垂體中表達(dá)量高于卵巢和下丘腦。這可能是由于禽類所處的就巢期階段不同和物種差異所導(dǎo)致。此外，基因的不同單倍型所表現(xiàn)出來的就巢行為也存在差異。梁勇等[17]發(fā)現(xiàn)催乳素基因內(nèi)含子2的第35堿基(T/C)位點、內(nèi)含子4的第1824堿基(A/G)位點的突變會導(dǎo)致家雞群體表現(xiàn)出不同的就巢率。

除和外，其他繁殖激素基因也被證實參與禽類就巢性的調(diào)控。吳國平[18]對浙東白鵝繁殖周期中、和基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)和的表達(dá)量在就巢期的浙東白鵝垂體中顯著下調(diào)表達(dá)。張響英等[19]檢測了處于不同繁殖周期的獅頭鵝3種組織中促卵泡素β亞基(follicle- stimulating hormone β,)和促卵泡素受體(follicle-stimulating hormone receptor,)基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明和在產(chǎn)蛋期的相對表達(dá)量極顯著高于就巢期和休產(chǎn)期，由此推測及表達(dá)水平的變化與鵝的繁殖周期密切相關(guān)。Wu等[20]對的研究也得到了相似的結(jié)果，就巢期番鴨下丘腦、垂體和卵巢等組織中的表達(dá)量顯著低于產(chǎn)蛋期。在禽類不同的繁殖周期中，、、和基因具有相似的表達(dá)模式，而和具有相反的表達(dá)模式。因此推測就巢禽類的部分組織中、、和的表達(dá)會受到和基因的抑制性調(diào)控，從而誘導(dǎo)就巢行為的發(fā)生；反之，在非就巢期禽類的體內(nèi)、、和的表達(dá)量上調(diào)則會抑制和基因的表達(dá)，從而抑制禽類的就巢行為的發(fā)生。綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)調(diào)控禽類繁殖行為的、、、、和基因都是參與就巢性調(diào)控的候選基因。

1.2 其他相關(guān)基因

就巢性是一種受多基因控制的復(fù)雜性狀，除了繁殖激素相關(guān)基因外，研究者還發(fā)現(xiàn)了其他參與就巢性調(diào)控的基因，如多巴胺D1/D2受體基因(dopamine D1/2 receptor,)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide,)及其受體(vasoactive inte-stinal polypeptide receptor,)基因等。和被證實參與了禽類繁殖行為的調(diào)控。Xu等[21]在探究基因及其單倍型對雞蛋產(chǎn)量和就巢性狀的影響時，發(fā)現(xiàn)基因4個SNP位點變異與就巢頻率顯著相關(guān)，且基因在非就巢雞的皮下和腹部脂肪中的表達(dá)顯著高于處于就巢期的雞?；蛑械膬蓚€位點A-16105G和T+619C也被認(rèn)為與鵝的就巢行為顯著相關(guān)，A-16105G主要與就巢頻率相關(guān)，而T+619C則參與調(diào)控就巢行為持續(xù)時間的長短[22]。此外，有研究表明及可能也是調(diào)控雞就巢性的候選基因。對斑胸草雀()就巢性的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雌性和雄性斑胸草雀處于就巢的情況下，其大腦中的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)[23]。Zhou等[24]發(fā)現(xiàn)基因序列中的C+598T和C+53327T的變異與禽類的就巢性顯著相關(guān)，前者主要與就巢頻率有關(guān)，而后者主要控制就巢持續(xù)時間的長短。相關(guān)的研究也表明基因的表達(dá)與多巴胺受體基因之間存在相互作用關(guān)系，VIP和PRL的分泌受下丘腦刺激性和抑制性的雙重作用[25,26]。

除上述4種基因外，Shen等[27]通過抑制性消減雜交技術(shù)(suppressive subtractive hybridization, SSH)分析證實GTP酶激活Rap/RanGAP域樣-1(GTPase activating Rap/RanGAP domain-like 1,)也是參與雞就巢性調(diào)控的候選基因，在就巢期的雞下丘腦和垂體中的表達(dá)水平顯著高于非就巢的雞。Xu等[28]通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)膽固醇側(cè)鏈裂解酶(cholesterol side-chain cleavage enzyme,)和多巴胺β-羥基酶(dopamine beta-hydroxylas,) 基因在就巢期的禽類卵泡中高度表達(dá)，這兩個基因可作為參與就巢性調(diào)控的候選基因。Liu等[29]通過比較就巢初期和產(chǎn)蛋期的鵝的下丘腦、垂體、卵巢基質(zhì)和非等級卵泡壁的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)素-神經(jīng)生長素(oxytocin-neurophysin,)、脊索生成素樣蛋白1 (chordin-like protein 1,)和生長激素(growth hormone,)可能是參與就巢性調(diào)控的新候選基因；此外，還發(fā)現(xiàn)下丘腦分泌素(hypocretin,)和阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin,)這兩個與食欲調(diào)控相關(guān)的基因在就巢初期鵝的下丘腦組織中顯著差異表達(dá)，因此推測就巢初期食欲減退可能是禽類就巢行為的第一步表現(xiàn)，同時也是引發(fā)鵝產(chǎn)生就巢行為的決定性因素。Liu等[7]利用全轉(zhuǎn)錄組技術(shù)比較分析就巢期和產(chǎn)蛋期雞的卵巢組織，篩選出大量與就巢性相關(guān)的基因：如與繁殖過程相關(guān)的基質(zhì)金屬肽酶2 (matrix metallopeptidase 2,)、細(xì)胞色素P450家族1亞家族B成員1 (cytochrome P450 family 1 subfamily B member 1,)、多巴胺β-羥化酶(dopamine beta-hydroxylase,)、抑制素β A/B(inhibin beta A/B,)和催產(chǎn)素受體 (oxytocin receptor,)基因等；與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的Smad家族成員2 (Smad family member 2,)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen- activated protein kinases 11,)、S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,)、受體相互作用蛋白激酶-1(receptor-interacting protein kinase-1,)、生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)45 (growth arrest and DNA damage-inducible 45,)基因和基因家族。

此外，褪黑素受體(melatonin receptor 1C,)[30]、抗繆勒氏管激素受體Ⅱ (Anti-Müllerian hormone receptor Ⅱ,)[31]、雷帕霉素靶蛋白基因(mec-hanistic target of rapamycin,)[32]、核受體輔激活蛋白1 (nuclear receptor co-activator 1,)、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2 (sterol regulatory element binding transcription factor 2,)、Ral GTP酶活化蛋白亞基α-1 (Ral-GTPase activating protein α-1,)[33]和垂體特異轉(zhuǎn)錄因子(POU- domain family of transcriptional activators,)[34]等基因也被證實參與禽類就巢性的調(diào)控(表1)。

2 參與就巢性調(diào)控的microRNAs

近期研究表明，microRNAs(miRNAs)參與哺乳動物的卵巢性腺發(fā)育、類固醇生成、細(xì)胞凋亡、排卵和禽類就巢性等過程的調(diào)控(表1)。Xu等[35]通過Solexa測序技術(shù)篩選出大量與禽類繁殖相關(guān)的miRNAs，其中G-miR-320、G-miR-202、G-miR-146和G-miR-143*被證實參與禽類就巢行為的調(diào)控。Chen等[36]利用高通量測序技術(shù)比較不同繁殖時期鵝的卵巢組織，也證實G-miR-146和G-miR-143*參與禽類就巢性的調(diào)控；此外，還發(fā)現(xiàn)let-7家族在兩個測試組中表達(dá)量最豐富，其次是miR-146家族和miR-143家族；在兩組卵巢組織中還篩選出4個新的差異表達(dá)的miRNAs，分別是miRn1、miRn10、miRn11和miRn12，且miRn1僅在就巢組中表達(dá)；對新的miRNAs進(jìn)行功能預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)miRn10和miRn11參與卵巢中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Yu等[37]也發(fā)現(xiàn)let-7、miR-10、miR-30和miR-199家族參與不同時期鵝卵泡的發(fā)育，并推測這4個miRNA家族是調(diào)控卵泡發(fā)育過程中的核心因素。Liu等[7]利用全轉(zhuǎn)錄組測序篩選出大量與就巢性相關(guān)的非編碼RNA，如p53信號通路中的重要調(diào)控因子miR-34b 和 miR-34c，參與卵巢類固醇合成調(diào)控的miR-18、miR-98、miR-128、miR-135和miR-148等。綜上所述，參與繁殖活動調(diào)控的miRNAs主要分為兩類：一類參與就巢期卵巢內(nèi)繁殖激素調(diào)節(jié)途徑；另一類調(diào)控卵巢內(nèi)體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的增殖與凋亡。

2.1 參與卵巢類固醇激素合成的microRNAs

卵巢中類固醇激素的水平與卵巢上卵泡的發(fā)育狀態(tài)和排卵有著直接的聯(lián)系，類固醇激素的合成受到許多酶和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。近年來的研究也證實miRNAs在調(diào)控卵巢類固醇合成中扮演著重要的角色。作為一個多功能的miRNA，miR-132被證實參與調(diào)控禽類卵巢中類固醇激素的合成。Sang等[38]發(fā)現(xiàn)miR-132在多囊卵泡綜合征患者的卵泡液中下調(diào)表達(dá)，并且參與卵泡中雌二醇的合成。Wu等[39]通過向體外培養(yǎng)小鼠的原代顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)入miR-132模擬物，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著上調(diào)顆粒細(xì)胞中雌激素的濃度，進(jìn)一步研究表明，miR-132主要是通過結(jié)合其靶基因孤兒核受體1 (neural orphan nuclear receptor 1,)基因，抑制的表達(dá)，進(jìn)而減少對細(xì)胞色素P450 19A1 (cytochrome P450 19A1,)基因的抑制作用，促進(jìn)雌二醇的生物合成。

表1 家禽就巢性相關(guān)基因及其信號通路

miR-320也被證實參與調(diào)控卵巢類固醇激素的合成。Zhang等[40]研究miR-320的表達(dá)對多囊卵巢綜合征患者卵丘細(xì)胞中雌二醇含量的影響，發(fā)現(xiàn)miR- 320主要是通過miR-320a//()級聯(lián)系統(tǒng)來調(diào)控卵丘細(xì)胞中胰島素樣生長因子1 (insulin-like growth factor 1,)基因誘導(dǎo)的孕酮和雌二醇產(chǎn)生，抑制miR-320a表達(dá)會顯著降低正常卵丘細(xì)胞中孕酮和雌二醇產(chǎn)生。Sang等[38]為了探究人卵泡液中與類固醇合成有關(guān)的miRNAs，將選擇的12個miRNAs類似物和抑制劑轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的人卵巢顆粒樣腫瘤細(xì)胞(steroidogenic human granulosa- like tumor cell line, KGN)中，發(fā)現(xiàn)miR-320類似物能夠促進(jìn)雌二醇的分泌，添加其抑制劑會導(dǎo)致雌二醇分泌降低。

此外，也有研究表明miRNAs可以通過調(diào)控顆粒細(xì)胞中芳香化酶基因的表達(dá)來影響雌二醇的合成。Xu等[41]發(fā)現(xiàn)miR-378通過與芳香化酶基因的3￠-UTR中的兩個結(jié)合位點結(jié)合，干擾芳香化酶的正常功能，以此來減少豬卵泡顆粒細(xì)胞中雌二醇的產(chǎn)生。Yao等[42]的研究則發(fā)現(xiàn)miR-224在轉(zhuǎn)化生長因子β 1 (transforming growth factor beta, TGF-β1)處理的小鼠腔前顆粒細(xì)胞(granulosa cell, GC)中顯著上調(diào)表達(dá)，miR-224可以靶向結(jié)合來增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的GC細(xì)胞增殖，并且miR-224和TGF-β1均可通過增加的轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)GC細(xì)胞釋放雌二醇。

2.2 參與卵巢細(xì)胞增殖和凋亡的microRNAs

處于就巢期的禽類，其生殖器官在功能上顯著退化。先前的研究不僅證實了就巢期禽類的卵巢中類固醇生成減少，也發(fā)現(xiàn)在就巢期禽類的卵巢中細(xì)胞增殖和凋亡過程顯著減緩[7]。大量研究表明，miRNAs參與許多通路中細(xì)胞增殖和凋亡基因的表達(dá)調(diào)控。miR-202主要在脊椎動物的性腺中表達(dá)，近期關(guān)于miR-202的研究主要集中在其對腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控方面，證實miR-202是多種疾病早期診斷的標(biāo)志物。此外，也有研究表明miR-202參與繁殖相關(guān)活動的調(diào)控。Xu等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-202在就巢期鵝的卵泡中顯著上調(diào)表達(dá)。Zhang等[43]發(fā)現(xiàn)miR-202-5p主要在斑馬魚()的卵母細(xì)胞中表達(dá)和積累。Gay等[44]利用CRISPR/ Cas9技術(shù)對青鳉()體內(nèi)的miR-202進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)miR-202缺失會損害早期卵泡的發(fā)育，降低卵巢中成熟卵泡的數(shù)量和質(zhì)量，證實miR-202是參與調(diào)節(jié)雌性卵泡募集和生長的關(guān)鍵miRNA。除了參與卵泡的生長發(fā)育調(diào)控，miR-202還能協(xié)同雌激素調(diào)控雞胚胎的性別分化，miR-202的上調(diào)與雞胚性腺中的雄性睪丸的分化一致[45]。

miR-320在調(diào)控就巢期禽類卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡中也發(fā)揮了重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-320在就巢期的鵝卵巢中的表達(dá)量顯著低于產(chǎn)蛋期[35]。Feng等[46]研究發(fā)現(xiàn)，在分裂細(xì)胞數(shù)量較多的早期胚胎中，miR-320的表達(dá)量顯著高于分裂細(xì)胞數(shù)量較少的早期胚胎，敲除小鼠卵母細(xì)胞中mmu-miR-320會顯著抑制卵母細(xì)胞的進(jìn)一步分裂。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-320在調(diào)控顆粒細(xì)胞的功能中發(fā)揮著重要的作用。如Yin等[47]發(fā)現(xiàn)miR-320主要在發(fā)育階段的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中表達(dá)；此外，miR-320可以通過靶向結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F1和SF-1蛋白調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育中顆粒細(xì)胞的增殖。

除了上述兩種miRNAs，有研究證實miR-224[48]、miR-26a-5p[49]、miR-148b[50]和miR-214[51]等也參與卵巢中卵泡的發(fā)育和顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞的增殖調(diào)控。近期的研究發(fā)現(xiàn)，大量與細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)的miRNAs在就巢期和產(chǎn)蛋期的禽類下丘腦、卵巢和卵泡中差異表達(dá)，如miR-21[52]、miR-204[53]、miR-205[54]、G-miR-34b-5p、miR-6006和G-miR-1620[7]等。

miR-205是一種高度保守的miRNA，能夠通過多條途徑調(diào)控細(xì)胞的凋亡。Tian等[55]發(fā)現(xiàn)miR-205可以直接靶向結(jié)合抗凋亡基因，通過調(diào)控的表達(dá)來抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Zhang等[56]證實miR-205在患慢性腎病小鼠的腎細(xì)胞中顯著下調(diào)表達(dá)，通過體內(nèi)、體外實驗證實miR-205通過與趨化因子樣因子(CKLF)樣MARVEL跨膜結(jié)構(gòu)域家族成員4 (Chemokine-like factor (CKLF)-like MARVEL transmembrane domain-containing family,) mRNA的3'UTR結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡。此外，也有研究證實miR-205參與繁殖活動的調(diào)控。如Zhang等[54]研究miR-205在小鼠顆粒細(xì)胞(mGCs)中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在閉鎖的卵泡中miR-205的表達(dá)量顯著增加，環(huán)腺苷一磷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1 (cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein 1,)是其直接的靶向基因；同時發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR- 205可以通過改變小鼠卵泡中促凋亡因子的活性來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

另一個高度保守的miR-10家族也被證實參與細(xì)胞的增殖和凋亡。Yu等[37]研究發(fā)現(xiàn)，miR-10家族成員在就巢期和產(chǎn)蛋期的鵝卵泡中高度表達(dá)。方芳等[57]發(fā)現(xiàn)miR-10b能夠靶向結(jié)合腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，)，通過抑制的表達(dá)來抑制山羊卵巢顆粒細(xì)胞的活性。Tu等[58]在探究miR-10家族成員對卵泡發(fā)育的調(diào)控作用時，發(fā)現(xiàn)miR-10a和miR-10b在卵泡成熟過程中表達(dá)量逐漸減少，但在卵泡閉鎖時期表達(dá)量增加；通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-10a和miR-10b能通過抑制和TGF-β途徑中的關(guān)鍵因子的表達(dá)來抑制卵泡中顆粒細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡；此外，F(xiàn)SH和FSH介導(dǎo)因子—環(huán)腺苷一磷酸(cyclic adenosinemonophosphate, cAMP)能夠抑制顆粒細(xì)胞中miR-10a和miR-10b的表達(dá)，從而降低miR-10a和miR-10b對顆粒細(xì)胞增殖的抑制。研究證實FSH在就巢期禽類的卵巢中含量顯著低于產(chǎn)蛋期[5,10,11]，因此推測就巢期FSH含量的降低減少了對miR-10a和miR-10b的抑制，導(dǎo)致卵泡顆粒細(xì)胞增殖受到抑制。

綜上所述，miR-202、miR-320家族、miR-205家族和miR-10家族在調(diào)控就巢期禽類卵巢生理功能中發(fā)揮了重要作用。

3 參與就巢性調(diào)控的相關(guān)信號通路

禽類的就巢性是一個受多種因素調(diào)控的復(fù)雜性狀，其中繁殖激素含量的改變和卵巢功能退化是就巢期禽類的典型特征。從產(chǎn)蛋期進(jìn)入就巢期，該過程涉及多條信號通路的參與(表1)。大量的研究證實，參與禽類就巢性調(diào)控的基因主要富集于細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡通路。Liu等[7]利用全轉(zhuǎn)錄組技術(shù)比較分析就巢期和產(chǎn)蛋期雞的卵巢組織，通過GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因主要富集于PI3K-Akt信號傳導(dǎo)、cGMP-PKG信號傳導(dǎo)、FoxO信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、Hippo信號傳導(dǎo)、MAPK信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和TGF-β信號傳導(dǎo)等途徑；其中大部分通路參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。除上述的細(xì)胞增殖和凋亡通路外，部分差異表達(dá)的基因還富集在與繁殖相關(guān)的通路上。Xu等[35]通過Solexa測序技術(shù)篩選出大量的與繁殖和就巢性相關(guān)的miRNAs，通過對靶基因的功能進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)基因富集最多的通路是繁殖通路，包括TGF-β信號通路、GnRH信號通路和類固醇激素生物合成信號通路。

3.1 類固醇激素的生物合成

就巢期禽類的卵巢高度萎縮，顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致卵泡內(nèi)合成的類固醇激素的含量降低。雌二醇和孕酮是參與禽類就巢性調(diào)控的兩種主要的類固醇激素，由卵泡的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞合成，這一過程主要受FSH的調(diào)控。FSH可以通過FSH-cAMP-蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)通路調(diào)控顆粒細(xì)胞中類固醇激素的合成。FSH與膜上的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，激活下游的腺苷酸環(huán)化酶和PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控參與雌二醇和孕酮合成的基因轉(zhuǎn)錄水平，影響卵泡中類固醇激素的合成。Cui等[59]在體外培養(yǎng)的3T3-L1細(xì)胞中添加FSH，發(fā)現(xiàn)能夠提高細(xì)胞中雌二醇的含量，同時檢測細(xì)胞中膽固醇、孕酮含量和cAMP-PKA通路以及過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR)途徑中的相關(guān)基因的表達(dá)量，證實在體外培養(yǎng)的3T3-L1細(xì)胞中，F(xiàn)SH能夠通過激活cAMP- PKA通路，活化下游基因與過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPARγ)的結(jié)合，促進(jìn)膽固醇向雌激素的轉(zhuǎn)化。此外，F(xiàn)SH還可以通過FSH-P38 MAPK-StAR/ P450arom通路調(diào)控顆粒細(xì)胞中類固醇激素的生成。Yu等[60]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH通過兩條不同的途徑誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞中雌激素和孕酮的生成，F(xiàn)SH激活P38MAPK通路，P38MAPK激活下游的孤兒受體家族的肝臟受體同源物-1 (liver receptor homolog-1,)基因，調(diào)控芳香化酶家族的表達(dá)，進(jìn)而影響顆粒細(xì)胞中雌激素的合成；此外，由FSH激活的P38MAPK途徑能夠誘導(dǎo)下游另一個孤兒受體基因(orphan receptor-1,)的活化，進(jìn)而影響類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,)基因的轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)控顆粒細(xì)胞中孕酮的合成。

FSH誘導(dǎo)的TGF-β信號通路也被證實參與顆粒細(xì)胞中類固醇激素生成的調(diào)控。Liang等[61]研究證實FSH能夠協(xié)同通過Smad途徑調(diào)控顆粒細(xì)胞中雌激素的合成；此外，還可以協(xié)同來調(diào)控的表達(dá)，最終影響顆粒細(xì)胞中雌激素的釋放。Lai等[62]發(fā)現(xiàn)FSH也能夠通過激活顆粒細(xì)胞中的，誘導(dǎo)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)的去磷酸化，激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄共激活因子2 (CREB regulated transcription co-activator 2,)的活性，而則參與調(diào)節(jié)、和羥基δ5類固醇脫氫酶3β(hydroxy delta 5 steroid dehydrogenase 3 beta,)的表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞中孕酮的產(chǎn)生。

叉頭轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子2 (forkhead transcriptional regulator 2,)是一種基因轉(zhuǎn)錄因子，在禽類卵泡中主要參與顆粒細(xì)胞功能的調(diào)控。有研究表明，F(xiàn)OXL2能夠誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞中雌激素的合成。Wang等[63]的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2通過兩條途徑激活芳香酶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控羅非魚()卵巢中類固醇激素的合成，其中可以直接通過其叉頭結(jié)構(gòu)域與基因的啟動子結(jié)合，激活的轉(zhuǎn)錄；此外，也可以通過叉頭結(jié)構(gòu)域與Ad4BP/SF-1的配體結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成異二聚體，并增強(qiáng)Ad4BP/SF-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。毛巖等[64]探究DNAJ同源亞家族B成員11 (DNAJ homolog subfamily B member 11,)與在調(diào)控小鼠卵泡顆粒細(xì)胞中雌激素合成中的互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)能夠靶向結(jié)合基因，增強(qiáng)FOXL2蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)下游誘導(dǎo)的的轉(zhuǎn)錄活性，從而增強(qiáng)顆粒細(xì)胞中雌二醇的合成。Li等[65]也證實在雌激素合成中發(fā)揮了重要的作用，敲除雌性羅非魚基因后，羅非魚體內(nèi)的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的變性，血清雌二醇-17β水平和芳香酶基因表達(dá)顯著降低；因此，推測可能通過調(diào)控芳香酶基因的表達(dá)來影響雌激素的合成。Folger等[66]發(fā)現(xiàn)可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物(cocaine- and amphetamine-regulated transcript, CART)信號通路也參與了不同發(fā)育階段卵泡顆粒細(xì)胞中雌激素的調(diào)控，抑制CART信號傳導(dǎo)會影響發(fā)育后期的卵泡中雌二醇合成；此外，在顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)中添加CART成熟肽，能夠減少FSH刺激的體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞中雌二醇的產(chǎn)生。

3.2 細(xì)胞增殖與凋亡

眾多轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究結(jié)果顯示，在就巢期和產(chǎn)蛋期的禽類卵巢中差異表達(dá)的基因主要富集于細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡通路。這與就巢期禽類卵巢的形態(tài)學(xué)觀測結(jié)果相符，與產(chǎn)蛋期相比，就巢期禽類的卵巢體積顯著萎縮，卵巢表面無等級卵泡的發(fā)育。Yu等[37]對差異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)除了報道較多的繁殖通路顯著富集外，在卵泡中還存在顯著富集的細(xì)胞增殖和凋亡通路，如MAPK信號通路、細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用，以及卵泡發(fā)生中的Wnt信號通路等。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，就巢期萎縮卵巢中下調(diào)的基因主要富集在PI3K-Akt信號通路、ECM受體相互作用、Jak-STAT信號通路和TGF-β信號通路中，而在就巢期萎縮卵巢中上調(diào)的基因則主要富集于類膽堿突觸、吞噬體、Notch信號通路和視黃醇代謝通路。

PI3K-Akt信號通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和代謝等多種生理活動中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，PI3K-Akt通路參與調(diào)控卵巢和卵泡中細(xì)胞的增殖。高雪等[67]探究結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,)對顆粒細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)抑制基因的表達(dá)會降低PI3K、P-AKT蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制顆粒細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。因此，推測可能是通過PI3K/AKT信號通路來發(fā)揮其調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的功能。先前的研究也證實PI3K/AKT通路是轉(zhuǎn)導(dǎo)FSH信號的關(guān)鍵途徑。如Hunzicker-Dunn等[68]利用FSH刺激體外培養(yǎng)的大鼠顆粒細(xì)胞，并探究PKA和生長因子受體結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白2 (growth factor receptor-bound protein-associated binding protein 2,)基因在卵巢顆粒細(xì)胞中對FSH刺激的PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑的作用，發(fā)現(xiàn)FSH刺激細(xì)胞后，激活PKA和下游的胰島素受體底物-1 (insulin receptor substrate-1,)、的表達(dá)；GAB2作為PKA的錨定蛋白，能夠促進(jìn)PKA與IRS-1復(fù)合物的形成，增強(qiáng)IRS1對下游PI3K/AKT信號途徑的激活作用，最終起到促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)類固醇和蛋白質(zhì)激素基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和啟動顆粒細(xì)胞分化的作用。Law等[69]的研究充分闡明了FSH刺激的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)-cAMP- PKA-PP1/MYPT1-IGF/IGFIR/IRS1-PI3K/AKT通路在調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖中的反應(yīng)機(jī)制，利用FSH刺激體外培養(yǎng)的腔前顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FSH可以通過GPCR直接激活PKA和蛋白磷酸激酶1 (protein phosphatase 1,PP1)的表達(dá)；此外，激活的PKA還可以通過促進(jìn)肌球蛋白磷酸酶靶向亞基1 (myosin phosphatase targeting subunit 1, MYPT1)的磷酸化來進(jìn)一步激活PP1；激活的PP1cβ/MYPT1能夠促進(jìn)下游IRS1絲氨酸多位點去磷酸化和IRS1 YXXM的磷酸化，進(jìn)而激活PI3K/AKT信號途徑，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖。這種機(jī)制不僅存在于卵巢腔前顆粒細(xì)胞中，同樣也存在于排卵前的顆粒細(xì)胞中。就巢期的禽類卵巢內(nèi)，顆粒細(xì)胞數(shù)量銳減，F(xiàn)SH的含量也顯著降低。因此，F(xiàn)SH誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號途徑受到抑制，最終導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的增殖和類固醇的合成受到抑制。

TGF-β通路不僅參與卵巢顆粒細(xì)胞中類固醇激素的合成，同樣也被證實參與調(diào)控卵巢內(nèi)細(xì)胞的增殖和凋亡。TGF-β信號通路主要通過激活下游的接頭蛋白SMADs和不同miRNAs的表達(dá)，參與卵巢顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控。Du等[70]探究在濾泡閉鎖中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)TGF-β/SMAD4-miR- 143-FSHR信號途徑在調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用，激活TGF-β信號途徑，能夠促進(jìn)下游的SMAD4接頭蛋白的表達(dá)，SMAD4能夠靶向結(jié)合miR-143，下調(diào)miR-143的表達(dá)，進(jìn)而降低miR-143對基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用，減少miR-143誘導(dǎo)的GC細(xì)胞凋亡。除上述在經(jīng)典TGF-β通路中發(fā)揮正向調(diào)控作用的SMAD4蛋白外，SMAD7蛋白也能夠通過負(fù)反饋調(diào)控的方式參與TGF-β信號通路對細(xì)胞周期的調(diào)控。Gao等[71]證實在體外培養(yǎng)的小鼠顆粒細(xì)胞中，、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 (bone morp-hogenetic protein 4,)和生長轉(zhuǎn)化因子9 (growth differentiation factor 9,)基因能夠促進(jìn)的表達(dá)，而則可以通過與靶向結(jié)合，降低TGF-βR1-SMAD2/3信號傳導(dǎo)的活性，負(fù)反饋調(diào)控TGF-β信號通路對細(xì)胞增殖的作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)，能夠通過調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)控TGF-β信號傳導(dǎo)途徑，增強(qiáng)豬顆粒細(xì)胞的凋亡；但miR-181b和miR-92a則可以靶向結(jié)合，減弱對TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控作用，抑制GC凋亡[72,73]。

Notch信號通路在胞間信號傳導(dǎo)和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要的作用，主要是通過受體Notch1-4與DSL (Delta/Serrate/lag-2)蛋白結(jié)合，將信號傳遞給下游的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(helix-loop-helix trans-cription factors,), myc原癌基因家族(myc protooncogene family,)等信號分子，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生理功能的作用。近期有研究表明，Notch信號通路在早期卵泡的發(fā)育和胚胎的形成中發(fā)揮著重要的作用，影響細(xì)胞的增殖，分化和凋亡。Irles等[74]發(fā)現(xiàn)Notch信號通路能夠維持德國小蠊()的卵泡處于一種既不發(fā)育也不凋亡的穩(wěn)定狀態(tài)。Trombly等[75]探究Notch信號傳導(dǎo)對原始卵泡形成的影響，發(fā)現(xiàn)及其配體基因和下游靶基因、等在新生小鼠的卵巢中表達(dá)，在體外卵巢培養(yǎng)系統(tǒng)中抑制Notch信號通路，發(fā)現(xiàn)卵巢上原始卵泡的百分比顯著降低，而生殖細(xì)胞的百分比顯著增加。Jing等[76]利用DAPT抑制山羊卵泡細(xì)胞中的Notch信號途徑，顯著降低了卵泡中顆粒細(xì)胞的數(shù)量，同時阻遏Notch信號途徑也會降低芳香酶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響雌二醇的合成。同時還發(fā)現(xiàn)Notch信號通路主要是通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控顆粒細(xì)胞的發(fā)育。此外，在近期的研究中也發(fā)現(xiàn)Notch信號通路協(xié)同P13K/ Akt、MAPK和ERK通路共同調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。Prasasya等[77]發(fā)現(xiàn)鋸齒狀典型Notch配體1 (jagged canonical Notch ligand 1,)是小鼠卵巢中表達(dá)最多的Notch配體，敲除和免疫球蛋白κJ區(qū)域的重組信號結(jié)合蛋白基因(recombin-ation signal binding protein for immunog-lobulin kappa J region,)，會抑制顆粒細(xì)胞的分化，降低顆粒細(xì)胞中的類固醇合成因子和相關(guān)酶的表達(dá)量，影響類固醇的合成和分泌；而抑制的表達(dá)能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖。

4 結(jié)語與展望

禽類的就巢性是一種由多基因控制的低遺傳力性狀，主要受環(huán)境、內(nèi)分泌和遺傳等因素的影響，其中遺傳因素是決定性因素。繁殖激素是誘導(dǎo)就巢行為產(chǎn)生的直接原因，其中PRL是調(diào)控就巢行為產(chǎn)生和維持的主要因素，因此和是繁殖相關(guān)激素基因中調(diào)控就巢性的主要候選基因，、、、、、和等基因通過調(diào)控和基因的表達(dá)來調(diào)控禽類就巢行為的產(chǎn)生和維持。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究同樣也證實了HPG軸相關(guān)激素及其基因在調(diào)控就巢行為中的重要作用；通過相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究篩選出了大量的與繁殖和就巢性相關(guān)的蛋白編碼基因和miRNAs，并初步揭示了調(diào)控就巢行為的生物學(xué)通路，如MAPK信號傳導(dǎo)、TGF-β信號傳導(dǎo)、催產(chǎn)素信號傳導(dǎo)、GnRH信號傳導(dǎo)和雌激素信號傳導(dǎo)等。雖然近幾年在轉(zhuǎn)錄組水平上篩選出了大量的與就巢性相關(guān)的候選基因和通路，但這些候選基因之間的互作關(guān)系、miRNA對基因的調(diào)控方式以及調(diào)控就巢性狀的具體分子機(jī)制還不清楚，關(guān)于禽類就巢性的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也未見報道。此外，目前關(guān)于禽類就巢性的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究主要局限在卵巢、卵泡和下丘腦這3種組織中，缺少對于PRL合成和釋放的垂體組織的研究。因此，在以后的研究中需要對調(diào)控禽類繁殖的HPG軸上的相關(guān)組織器官進(jìn)行全面的分析，利用體外和活體實驗對篩選出來的新編碼基因和非編碼基因進(jìn)行具體功能的探索，同時利用全基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等多組學(xué)聯(lián)合分析以及高通量染色體構(gòu)象捕獲(high-througnput chromosome confor-mation capture, Hi-C)等新技術(shù)來進(jìn)一步揭示調(diào)控就巢行為的具體分子機(jī)制。

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Genetic regulation of broodiness in poultry

Lingqian Yin, Jinshan Ran, Jingjing Li, Peng Ren, Xianxian Zhang, Yiping Liu

Broodiness is a behavior commonly occurring in the poultry industry, which is characterized by inappetence, egg-laying cessation and incubation. Different from laying fowls, the ovary and oviduct of broodiness fowls is degenerate. Broodiness is a low heritability trait, which is controlled by multiple genes in autosomes and influenced by three factors, including environment, endocrine and genetics. In addition to the observation of behavioral characteristics, the current research of broodiness focuses on evaluating the genetic mode, endocrine factors, nesting candidate genes and their polymorphisms in poultry. Given the rapid development of high-throughput sequencing, the joint analyses of genomics, transcriptomics and proteomics have been used to screen out the candidate genes, pathways and molecular mechanism of broodiness. In this review, we summarize the candidate genes, microRNAs and pathways involved in broodiness to provide a reference for further research on poultry broodiness.

poultry; broodiness; reproductive hormone; candidate gene; microRNA; signaling pathway

2018-11-21;

2019-03-20

四川省育種攻關(guān)項目(編號：2016NYZ0043)和四川省省院省?？萍己献餮邪l(fā)項目(編號：2017JZ0033)資助[Supported by the Open Fund of Farm Animal Genetic Resources Exploration (No. 2016NYZ0043) and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province (No. 2017JZ0033)]

尹玲倩，碩士研究生，專業(yè)方向：家禽遺傳育種與繁殖。E-mail: 1061795429@qq.com

劉益平，博士，教授，研究方向：家禽遺傳育種與繁殖。E-mail: liuyp578@163.com

10.16288/j.yczz.18-316

2019/3/22 9:12:26

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190322.0911.002.html

(責(zé)任編委: 李輝)