劉振寧，袁黎，Venkatesan Sundaresan，余小林

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擬南芥基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子篩選及鑒定

劉振寧1,2,3，袁黎2,4，Venkatesan Sundaresan2，余小林3

1. 臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，臨沂 276000 2. 加州大學(xué)戴維斯分校植物科學(xué)系，加利福尼亞州戴維斯 95616，美國(guó) 3. 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 310058 4. 西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，楊凌 712100

擬南芥CKI1 (cytokinin independent 1)是雙組分信號(hào)系統(tǒng)中一個(gè)組氨酸激酶蛋白，通過(guò)作用于下游組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白激活雙組分信號(hào)通路，在調(diào)控胚囊中央細(xì)胞命運(yùn)分化和發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。然而目前對(duì)于基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子還知之甚少。本研究分析了不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子在擬南芥胚囊中的活性，并利用酵母單雜交技術(shù)對(duì)上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進(jìn)行了篩選和鑒定。結(jié)果表明，位于內(nèi)含子區(qū)域中的片段表現(xiàn)出與啟動(dòng)子全長(zhǎng)相一致的表達(dá)活性。進(jìn)一步選取3個(gè)串聯(lián)重復(fù)的片段用于構(gòu)建誘餌表達(dá)載體，同時(shí)，選取擬南芥雌蕊構(gòu)建cDNA文庫(kù)，通過(guò)酵母單雜交篩選獲得226個(gè)陽(yáng)性克隆。去除低質(zhì)量及冗余重復(fù)的序列后共獲得66條可讀序列，其中8條序列對(duì)應(yīng)的基因編碼具有DNA結(jié)合功能的蛋白。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了重要參考信息。

；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；酵母單雜交；擬南芥

雙組分信號(hào)系統(tǒng)(two-component system, TCS)最初是在研究大腸桿菌()氮調(diào)節(jié)蛋白系統(tǒng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的[1]。最簡(jiǎn)單的雙組分信號(hào)系統(tǒng)包括用于感應(yīng)輸入信號(hào)的組氨酸激酶(histidine kinase, HK)和用于調(diào)節(jié)輸出信號(hào)的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(response regulator, RR)兩種元件，原核生物常以簡(jiǎn)單的雙組分信號(hào)系統(tǒng)形式存在。在細(xì)菌、酵母、粘液菌和植物中，雙組分信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)化為包括組氨酸激酶(histidine kinase, HK)、組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白(histidine phospho-transfer, HP)和反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(response regulator, RR)的多步磷酸化傳遞的雙組分信號(hào)系統(tǒng)。

CKI1(AT2G47430)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有細(xì)胞分裂素受體特征的組氨酸激酶蛋白，在不添加細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上，的過(guò)量表達(dá)能夠?qū)е绿禺惖募?xì)胞分裂素應(yīng)答反應(yīng)[2,3]。CKI1蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)膜上[3~5]。Deng等[6]采用qRT-PCR方法研究了基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)主要在擬南芥()的開(kāi)放花、角果和花蕾中表達(dá)。Hejatko等[7]利用原位雜交技術(shù)和啟動(dòng)子GUS融合蛋白分析表明，在胚囊發(fā)育的FG1 (female gametophyte 1)時(shí)期到成熟胚囊期FG7時(shí)期均穩(wěn)定表達(dá)，尤其在成熟胚囊期的中央細(xì)胞中表達(dá)量比較高，在卵細(xì)胞和助細(xì)胞中的表達(dá)量比較低。另外，在擬南芥花序的維管組織中也有明顯的表達(dá)信號(hào)[8]。功能缺失突變體()植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段沒(méi)有明顯的表型，但雌配子體表現(xiàn)為50%敗育的表型。遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，功能缺失的突變體其T-DNA插入位點(diǎn)不能通過(guò)母本傳遞到子代中，因而也無(wú)法獲得純合的功能缺失突變體。對(duì)突變體胚囊的細(xì)胞學(xué)觀察表明，突變體胚囊的敗育發(fā)生在FG4時(shí)期向FG5時(shí)期的轉(zhuǎn)換期[4,6,7,9]。水稻()中同源基因()的功能缺失突變體也表現(xiàn)出雌配子體敗育表型[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CKI1通過(guò)作用于下游AHP2、AHP3和AHP5調(diào)控中央細(xì)胞的命運(yùn)分化[5,11,12]，但是目前仍不清楚該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。Dobisova等[13]對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行EMS誘變，對(duì)上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)受到光敏色素蛋白的調(diào)控，并且啟動(dòng)子區(qū)域存在大量G-box和GATA motif等光周期響應(yīng)元件，進(jìn)一步通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)也證明PIF3和CCA1等受光敏色素蛋白調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子能夠與啟動(dòng)子區(qū)域互作。但是篩選到的光敏色素蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的突變體并沒(méi)有表現(xiàn)出突變體的表型，由此推測(cè)，在胚囊發(fā)育 的階段還存在其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠調(diào)控的表達(dá)。

酵母單雜交是根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合蛋白與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報(bào)告基因表達(dá)的原理，用來(lái)鑒定調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的上游轉(zhuǎn)錄因子基因的一種有效方法[14]。隨著酵母單雜交系統(tǒng)的不斷發(fā)展和完善，該方法近年來(lái)已被廣泛用于克隆和鑒定各種動(dòng)植物的轉(zhuǎn)錄因子。本研究利用酵母單雜交技術(shù)對(duì)上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進(jìn)行了篩選和鑒定，為進(jìn)一步揭示基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了新的數(shù)據(jù)及重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥Col-0野生型為本實(shí)驗(yàn)室保存。擬南芥種子先用含20% Bleach和0.1% Tween 20的消毒液進(jìn)行表面消毒10 min，然后使用滅菌的雙蒸水清洗3~5遍，置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待幼苗兩周大的時(shí)候，將幼苗轉(zhuǎn)移到帶有培養(yǎng)基質(zhì)(草炭∶蛭石∶珍珠巖為6∶3∶2)的穴盤(pán)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件保持16 h光照/8 h黑暗周期，溫度為22℃，相對(duì)濕度為60%。

1.2 不同片段長(zhǎng)度CKI1啟動(dòng)子載體的構(gòu)建

因?yàn)榻湍富蚪M比植物基因組小得多，酵母啟動(dòng)子一般都比較短，如果整合到酵母基因組中的外 源啟動(dòng)子太長(zhǎng)，可能會(huì)影響目的蛋白和啟動(dòng)子中順式作用元件結(jié)合的效率，而且會(huì)造成更多的假陽(yáng)性[15,16]。因此，酵母單雜交一般選用幾到幾十bp的特定順式作用元件或者盡可能短的有啟動(dòng)活性序列來(lái)構(gòu)建誘餌表達(dá)載體。首先將基因啟動(dòng)子平均分成若干區(qū)段，分別設(shè)計(jì)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。然后通過(guò)Ⅰ和Ⅰ雙酶切克隆到-CAMBIA1300中間載體中，構(gòu)建帶有相應(yīng)啟動(dòng)子片段的--CAMBIA1300表達(dá)載體(圖1)。

1.3 轉(zhuǎn)基因株系的篩選和觀察

經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證后，構(gòu)建成功的表達(dá)載體通過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1菌株中，并通過(guò)浸花轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到擬南芥野生植株中[17,18]。待轉(zhuǎn)化的擬南芥植株種子成熟，收集和干燥種子，然后通過(guò)上述擬南芥種子表面消毒和播種方法，將種子在含有25 mg/L潮霉素B的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，最后將篩選獲得的幼苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基質(zhì)中正常培養(yǎng)。

表1 本研究使用的引物信息

下劃線序列表示引物中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。

圖1 不同長(zhǎng)度的CKI1基因啟動(dòng)子活性分析載體構(gòu)建示意圖

啟動(dòng)子區(qū)域包括4段5′UTR(粉色區(qū)域)、3段內(nèi)含子(藍(lán)色區(qū)域)和5′UTR上游序列(紫色區(qū)域)。F、F1、F2、F3、F4、F5和R1、R2、R3分別為上、下游引物。

對(duì)擬南芥胚囊中熒光信號(hào)進(jìn)行觀察。首先在載玻片上滴幾滴滅菌的雙蒸水，然后在解剖鏡下將選取的雌蕊在雙蒸水中使用解剖針解剖開(kāi)，僅留下胚珠，去除多余的組織，蓋上蓋玻片，立即在熒光顯微鏡(Zeiss, Axioskop 2 plus)下觀察拍照。

1.4 誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建與酵母遺傳轉(zhuǎn)化

誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建和酵母遺傳轉(zhuǎn)化參照酵母單雜交試劑盒(Clontech公司，美國(guó))進(jìn)行。為提高轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件的識(shí)別率和結(jié)合率，在誘餌表達(dá)載體構(gòu)建中，本研究使用3個(gè)串聯(lián)重復(fù)的片段。首先，使用Ⅰ和Ⅰ雙酶切將第1個(gè)片段克隆到AbAi載體中，然后使用Ⅰ和Ⅰ雙酶切將第2個(gè)片段克隆到AbAi載體中，最后使用Ⅰ單酶切將第3個(gè)片段克隆到AbAi載體中，完成Bait-AbAi載體的構(gòu)建。每一步載體構(gòu)建均經(jīng)過(guò)了酶切和測(cè)序驗(yàn)證。然后將誘餌表達(dá)載體用BⅠ限制性內(nèi)切酶切成線性質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入YIH酵母菌株感受態(tài)中。最后選取5個(gè)單菌落，使用Matchmarker Insert Check PCR Mix 1試劑盒(Clontech公司，美國(guó))進(jìn)行菌落PCR鑒定含有誘餌表達(dá)載體的陽(yáng)性菌落，選取陽(yáng)性菌落備用。

1.5 抑制誘餌菌株生長(zhǎng)的最低AbA濃度的篩選

選取陽(yáng)性菌落活化，然后用適量的0.9%NaCl重懸菌液，調(diào)制600值約為0.002。分別在含0 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL、250 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL、500 ng/mL、600 ng/mL、800 ng/mL和1000 ng/mL等不同濃度AbA的SD/-Ura固體培養(yǎng)基涂布100 μL菌液，置于30℃培養(yǎng)2~3 d，觀察酵母菌落的生長(zhǎng)情況。

1.6 酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建與篩選

Smyth等[19]根據(jù)擬南芥花發(fā)育不同階段的形態(tài)特征將其劃分為12個(gè)時(shí)期。本研究選取擬南芥花發(fā)育階段在10~12時(shí)期的雌蕊提取RNA，然后將所提取的RNA按照Clontech公司單雜交文庫(kù)試劑盒的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成含有SMARTⅢ和CDSⅢ錨定末端的雙鏈DNA (double strand cDNA, dscDNA)。RNA提取參照Invitrogen公司RNA提取試劑TRIzol產(chǎn)品操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RNA純化參照QIAGEN公司RNA純化試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。第一、第二鏈cDNA的合成、dscDNA的純化參照Clontech公司酵母單雜交試劑盒進(jìn)行。

首先將制備好的3 μg dscDNA、6 μLGADT7- Rec載體(經(jīng)Ⅰ線性化處理)和20 μL鮭魚(yú)精子DNA (10 mg/mL)轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化液涂布在150 mm直徑含250 ng/mL濃度AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)板涂布大約150 μL，同時(shí)將100 μL稀釋100倍的轉(zhuǎn)化液涂布在SD/-Leu固體培養(yǎng)基平板上作為對(duì)照。將平板置于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3~5 d，觀察酵母菌落的生長(zhǎng)情況并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。

轉(zhuǎn)化效率滿足要求后，將線性化的融合表達(dá)載體GADT7-Rec2和獲得的SMARTⅢ和CDSⅢ錨定末端的dscDNA同時(shí)轉(zhuǎn)入YIH Gold[Bait/AbAi]酵母感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化液涂布在含250 ng/mL濃度AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基平板上，在30℃條件下培養(yǎng)3~5 d后觀察統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基上的單菌落數(shù)量。

1.7 陽(yáng)性克隆鑒定和測(cè)序

將能夠在含250 ng/mL濃度AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)一步在含300 ng/mL濃度AbA的SD/-Leu固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，經(jīng)過(guò)3次劃線后均生長(zhǎng)的克隆被認(rèn)為是陽(yáng)性克隆。選取陽(yáng)性克隆，搖菌，提取酵母質(zhì)粒。以酵母質(zhì)粒為模板，使用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2試劑盒(Clontech公司，美國(guó))擴(kuò)增目的片段，將凝膠回收的目的片段連接到T載體上，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。引物序列見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同長(zhǎng)度的CKI1基因啟動(dòng)子活性分析

根據(jù)前人對(duì)啟動(dòng)子活性的研究，F(xiàn)R2序列(1661 bp)是啟動(dòng)子啟動(dòng)活性所必需的[6,7]，但對(duì)于酵母單雜交來(lái)說(shuō)并不是特別理想的啟動(dòng)子長(zhǎng)度。為進(jìn)一步獲得啟動(dòng)子盡可能短的功能序列，本研究在FR2啟動(dòng)子不同區(qū)間設(shè)計(jì)引物進(jìn)行分段擴(kuò)增。首先將序列截短成(1080 bp)、(1661 bp)、(698 bp)、(1279 bp)、(488 bp)、(1069 bp)、(301 bp)和(882 bp)等8個(gè)片段(圖1)，并分別構(gòu)建了表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，觀察轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株胚囊中的啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明，只有、、和這4段序列具有啟動(dòng)子活性。隨后，將這一段序列再次截短為(224 bp)、(581 bp)和(382 bp)等3個(gè)片段，分別構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，觀察轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株胚囊中的啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明，只有和這兩段序列具有啟動(dòng)子的活性(圖2，A~P)，其表達(dá)模式與啟動(dòng)子全長(zhǎng)的表達(dá)模式一致[5]。研究結(jié)果表明，能夠被轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的順式作用元件位于這個(gè)區(qū)間的內(nèi)含子區(qū)域。進(jìn)一步通過(guò) PLACE和PlantCARE在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具對(duì)該內(nèi)含子區(qū)域轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行分析，結(jié)果表明該區(qū)域存在對(duì)光照、晝夜節(jié)律、厭氧感應(yīng)，以及細(xì)胞分裂素和茉莉酸甲酯兩種植物激素響應(yīng)的元件(圖3)。

圖2 CKI1基因啟動(dòng)子片段F5/R2在胚囊中的啟動(dòng)活性

A和B：大孢子母細(xì)胞時(shí)期；C和D：功能大孢子時(shí)期~FG1時(shí)期；E和F：FG2~FG3時(shí)期；G和H：FG4時(shí)期；I和J：FG5時(shí)期；K和L：FG6時(shí)期；M~P：FG7時(shí)期。兩個(gè)極核剛完成融合時(shí)，在助細(xì)胞和卵細(xì)胞中能檢測(cè)到啟動(dòng)子活性，但隨后助細(xì)胞和卵細(xì)胞中的信號(hào)消失，僅反足細(xì)胞和中央細(xì)胞中具有啟動(dòng)子活性。標(biāo)尺為20 μm。

圖3 內(nèi)含子F5/R2區(qū)域中轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的預(yù)測(cè)

2.2 酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建和篩選

2.2.1 誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究選取序列作為誘餌序列，并將3個(gè)串聯(lián)重復(fù)的片段克隆到AbAi載體中，構(gòu)建誘餌表達(dá)載體3×F5/R2-AbAi。鑒于誘餌表達(dá)載體存在報(bào)告載體的本底表達(dá)，本文首先測(cè)試了含有誘餌表達(dá)載體的3×-AbAi的YIH Gold酵母菌株(YIH Gold [Bait/AbAi])在不同濃度AbA中生長(zhǎng)的情況。與對(duì)照相比，AbA能明顯地抑制含有誘餌表達(dá)載體的YIH Gold菌株的生長(zhǎng)(圖4，A~J)。在含有100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL濃度AbA的培養(yǎng)基中依然有少數(shù)菌落的生長(zhǎng)，而250 ng/mL濃度以上的AbA能徹底抑制酵母的生長(zhǎng)。因此，250 ng/mL濃度的AbA被確定為后續(xù)文庫(kù)篩選最合適的濃度。

2.2.2 酵母單雜交文庫(kù)的建立和篩選

dscDNA經(jīng)檢測(cè)滿足建庫(kù)要求，融合表達(dá)載體GADT7-Rec2轉(zhuǎn)入YIH Gold[Bait/AbAi]酵母感受態(tài)中的效率為1.125×106cfu/μg，也高于1×105cfu/μg的最低轉(zhuǎn)化率要求。將含有250 ng/mL AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基上篩選到的單克隆菌落接種到新的含有300 ng/mL AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，此過(guò)程重復(fù)兩次。經(jīng)過(guò)3次劃線接種均生長(zhǎng)的克隆，被認(rèn)為是陽(yáng)性克隆。經(jīng)過(guò)3次篩選最終獲得226個(gè)陽(yáng)性克隆。

圖4 測(cè)試含誘餌表達(dá)載體的YIH Gold酵母菌株在含有不同濃度AbA的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

A：不含AbA；B：100 ng/mL AbA；C：150 ng/mL AbA；D：200 ng/mL AbA；E：250 ng/mL AbA；F：300 ng/mL AbA；G：400 ng/mL AbA；H：500 ng/mL AbA；I：600 ng/mL AbA；J：800 ng/mL AbA。

2.2.3 目的序列的基因功能注釋

將上述獲得的226個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，然后將測(cè)序結(jié)果與擬南芥基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因進(jìn)行比對(duì)，去除低質(zhì)量及冗余重復(fù)的序列，共獲得66條可讀序列。對(duì)這66條可讀序列進(jìn)行基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)8個(gè)具有DNA結(jié)合功能的蛋白，包括RING/ FYVE/PHD zinc finger家族蛋白、染色質(zhì)組裝修飾蛋白、組蛋白、AUX/IAA蛋白等(表2)。根據(jù)中央細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)[20]，進(jìn)一步分析了這8個(gè)候選基因在中央細(xì)胞中的表達(dá)情況，除了在中央細(xì)胞中不表達(dá)，其余7個(gè)基因在中央細(xì)胞中都有一定的表達(dá)量。因此，這7個(gè)基因可能是上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的候選基因。除了轉(zhuǎn)錄因子外，本研究還發(fā)現(xiàn)其中36個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果為一個(gè)功能未知基因—。該基因編碼雜相RNA(miscellaneous RNA)，是一類龐雜的小RNA分子，具有類酶催化、RNA加工和控制基因表達(dá)開(kāi)關(guān)的作用[21]。目前對(duì)miscellaneous RNA研究極少，其具體的功能機(jī)制尚不清楚。

3 討論

3.1 CKI1基因的內(nèi)含子具有啟動(dòng)子功能

絕大多數(shù)真核生物的基因是斷裂基因，由外顯子和內(nèi)含子間隔組成。外顯子是真核生物基因中編碼蛋白質(zhì)的序列，而內(nèi)含子為非編碼蛋白序列。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子并非垃圾序列，內(nèi)含子對(duì)基因的表達(dá)存在調(diào)控作用。目前在很多基因的內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了基因表達(dá)的調(diào)控元件，內(nèi)含子具有啟動(dòng)子的功能。Chang[22]發(fā)現(xiàn)豬基因內(nèi)含子中存在重要的調(diào)控元件，可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄的起始來(lái)增強(qiáng)基因的表達(dá)。Salgueino等[23]發(fā)現(xiàn)玉米泛素基因的第一個(gè)內(nèi)含子能夠啟動(dòng)表達(dá)，具有類似于啟動(dòng)子的功能，對(duì)該內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特征的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子具有TATA box和CAAT box。謝先芝等[24]對(duì)番茄蛋白酶抑制劑Ⅱ基因的內(nèi)含子序列進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)序列具有啟動(dòng)子活性，能夠啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，序列中也存在著類似于真核基因啟動(dòng)子TATA box的結(jié)構(gòu)。小鼠基因第一個(gè)內(nèi)含子中存在一個(gè)基因，該內(nèi)含子能夠啟動(dòng)基因的表達(dá)，具有類似啟動(dòng)子的功能[25]。本研究通過(guò)對(duì)基因啟動(dòng)子的研究，發(fā)現(xiàn)基因第一個(gè)內(nèi)含子也具有啟動(dòng)子活性，并且在該區(qū)域內(nèi)鑒定到了能夠響應(yīng)光照、晝夜節(jié)律、厭氧反應(yīng)與植物激素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。但具體哪些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件能夠真正介導(dǎo)上游轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄激活仍需要進(jìn)一步研究。

3.2 CKI1基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的候選基因

轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控真核生物基因表達(dá)的重要因子，典型的轉(zhuǎn)錄因子都有DNA結(jié)合區(qū)，不同的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子的順式作用元件特異性結(jié)合并相互作用，從而激活或抑制靶基因的表達(dá)。酵母單雜交技術(shù)是一種體內(nèi)鑒定DNA與蛋白質(zhì)相互作用的有效方法。該系統(tǒng)篩選到的蛋白質(zhì)是在體內(nèi)相對(duì)自然條件下有結(jié)合功能的蛋白質(zhì)，比體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況。通過(guò)酵母單雜交系統(tǒng)，本研究篩選出到7個(gè)在中央細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因。同時(shí)，考慮到酵母單雜交的假陽(yáng)性問(wèn)題，今后有必要對(duì)這7個(gè)候選基因進(jìn)一步采用EMSA或者ChIP-qPCR驗(yàn)證酵母單雜交的篩選結(jié)果，以排除可能的假陽(yáng)性。前期研究表明，基因功能缺失突變體表現(xiàn)出50%的雌配子體敗育表型，由此推測(cè)，基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的突變體可能也具有雌配子體敗育的表型。研究顯示，只有[26]和[27]這兩個(gè)基因的功能缺失突變體沒(méi)有明顯的雌配子發(fā)育異常表型，其余5個(gè)基因的突變體是否具有雌配子發(fā)育異常表型尚不清楚。因此，上述5個(gè)基因是今后需要重點(diǎn)關(guān)注的候選基因。

表2 目的基因的功能注釋

3.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的高通量篩選

酵母單雜交技術(shù)目前是鑒定DNA和蛋白質(zhì)互作以及篩選轉(zhuǎn)錄因子常用的主流技術(shù)。利用特定序列的順式作用元件或者一段啟動(dòng)子序列篩選目的轉(zhuǎn)錄因子需要構(gòu)建cDNA文庫(kù)，而cDNA文庫(kù)存在基因冗余重復(fù)、基因序列不完整和非特異性的問(wèn)題，容易產(chǎn)生很多的假陽(yáng)性克隆和重復(fù)克隆，為后期的進(jìn)一步鑒定和驗(yàn)證增加了大量的工作量。本研究利用酵母單雜交技術(shù)對(duì)擬南芥雌蕊的cDNA文庫(kù)進(jìn)行了篩選，獲得了226個(gè)陽(yáng)性克隆，僅獲得66條可讀序列，其中轉(zhuǎn)錄因子基因只有8個(gè)，上述陽(yáng)性克隆存在著大量冗余重復(fù)的序列和低質(zhì)量的序列。為提高酵母單雜交篩選轉(zhuǎn)錄因子的效率和特異性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的高通量篩選技術(shù)日益受到重視。Castrillo等[16]構(gòu)建了包含1200個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)錄因子的文庫(kù)，在96孔板上通過(guò)傳統(tǒng)的酵母配對(duì)的方式對(duì)脂肪酶基因的上游轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了高通量的篩選，找到了的上游調(diào)控基因。利用同樣的方法，Ou等[28]構(gòu)建了包含1589個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)錄因子的文庫(kù)，篩選到了8個(gè)能夠調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。Pruneda-Paz等[15]構(gòu)建了包含1956個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)錄因子的文庫(kù)，篩選到了能夠結(jié)合到基因啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。這種轉(zhuǎn)錄因子高通量的篩選技術(shù)能夠直接篩選到與目的DNA互作的轉(zhuǎn)錄因子，避免了cDNA文庫(kù)篩選存在的過(guò)高的假陽(yáng)性問(wèn)題和冗余重復(fù)序列。這些擬南芥轉(zhuǎn)錄因子文庫(kù)在ABRC網(wǎng)站上都可以訂購(gòu)獲得，無(wú)疑對(duì)特定基因上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的篩選大有裨益。但上述轉(zhuǎn)錄因子篩選文庫(kù)使用的是擬南芥各器官混合建庫(kù)，針對(duì)器官或組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子篩選存在一定的局限性，因而進(jìn)一步完善針對(duì)特定發(fā)育時(shí)期或器官、組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子文庫(kù)具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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Screening and identification ofupstream transcription regulators in

Zhenning Liu1,2,3, Li Yuan2,4, Venkatesan Sundaresan2, Xiaolin Yu3

CKI1 (cytokinin independent 1) is a histidine kinase protein involved in the two-component system, which can activate two-component signalingthe downstream histidine phospho-transfer proteins, playing the essential roles in central cell fate determination and development regulation in embryo sacs. However, studies onupstream transcription regulators are still limited. In the present study, promoter activities with varying fragments were investigated, andupstream transcription regulators were screened and identified by the yeast-one hybrid technique. Results indicatedfragments located in the intron region showed promoter activities in embryo sacs, which is consistent withfull-length promoters. Then three tandem repeats offragments were used to construct the bait expression vector, andpistils were collected for cDNA library construction. Totally, 226 positive clones were screened by the yeast-one hybrid technique, 66 readable sequences were retrieved after removing sequences with low quality and redundant repeats, among which eight proteins could act as DNA-binding proteins. These results provided some important clues to study the molecular function of CKI1 in the transcription regulation network.

; transcription regulation; yeast-one hybrid;

2018-11-21;

2019-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31700272，31872110，31460521)，山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：ZR2017PC012)和浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目子課題(編號(hào)：2016C02051-6-1)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31700272, 31460521, 31872110), the Natural Science Foundation of Shandong Province (No. ZR2017PC012) and the Breeding Project of the Sci-tech Foundation of Zhejiang Province (No. 2016C02051-6-1)]

劉振寧，博士，講師，研究方向：植物生殖發(fā)育。E-mail: liuzhenning@lyu.edu.cn

余小林，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物功能基因組學(xué)。E-mail: xlyu@zju.edu.cn

10.16288/j.yczz.18-314

2019/4/2 17:11:57

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190402.1711.002.html

(責(zé)任編委: 張憲省)