段福先，孫冬梅，江潔怡，胥愛麗

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405; 2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095； 3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510095)

三白草來源于三白草科三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.，干燥地上部分入藥。其味甘、辛，性寒，歸肺、膀胱經(jīng)，有利尿消腫、清熱解毒的功效，用于治療水腫、小便不利、淋瀝澀痛、帶下，外治瘡傷腫毒、濕疹等[1]?，F(xiàn)代研究報(bào)道，三白草藥材含有揮發(fā)油、黃酮、木脂素、生物堿、鞣質(zhì)等成分，具有抗感染、去毒、降糖、保肝、利尿等活性[2]。三白草中木脂素類成分具有多方面藥理活性，如抗感染、抗氧化等[3]，三白草黃酮類成分具有很好的抑制超氧基陰離子和羥基自由基的作用[4]。近些年國(guó)內(nèi)外對(duì)三白草的研究不斷加深，使其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，而且在某些方面還呈現(xiàn)一定的開發(fā)前景。

目前，有關(guān)三白草質(zhì)量控制方面的研究多集中于三白草酮、里卡靈A等單一化學(xué)成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)[5-8]，指紋圖譜的研究雖也有相關(guān)報(bào)道[9]，但不夠完善。為進(jìn)一步完善三白草的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)采用HPLC法建立了三白草的指紋圖譜，對(duì)15批不同產(chǎn)地的三白草樣品進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，指認(rèn)了13個(gè)化學(xué)成分，所建立的HPLC指紋圖譜能夠較全面地反映三白草藥材的成分特征。并采用聚類分析進(jìn)行模式識(shí)別，深入分析影響三白草質(zhì)量的化學(xué)峰，能夠較全面的反映三白草藥材的質(zhì)量。

1 儀器、材料與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PAD檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TLE204電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；ALB-200型高速多功能粉碎機(jī)(上海塞耐機(jī)械有限公司)。

金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)：111521-201205，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-201409，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.8%)、槲皮苷對(duì)照品(批號(hào)：111538-200504，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.5%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：93.5%)、1′-表-三白草酮(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：85.3%)、(-)-三白草醇甲基醚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：97.6%)、三白草酮(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.5%)、三白草醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：93.3%)、saurucinolⅠ(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：92.0%)、里卡靈A(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.1%)、4-O-去甲基馬納薩亭B(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.5%)、馬納薩亭B(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：95.2%)、里卡靈B(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.8%)為中山大學(xué)徐俊教授團(tuán)隊(duì)提供，從三白草藥材中分離鑒定；甲醇為色譜純[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析純。

15批三白草批號(hào)及產(chǎn)地來源見表1，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院劉法錦教授鑒定為三白草科植物三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.的干燥地上部分。

表115批三白草樣品信息表

Table1Sources of 15 batches ofSaururuschinensis(Lour.) Baill

編號(hào)產(chǎn)地 收集日期編號(hào)產(chǎn)地 收集日期S1湖北2016-12S9安徽2016-12S2湖北2016-12S10廣西2016-12S3湖北2016-12S11廣西2016-12S4四川2016-12S12湖北2016-07S5河北2016-12S13云南2016-12S6河北2016-12S14云南2016-12S7浙江2016-12S15湖北2016-11S8浙江2016-12

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters XbridgeTMC18色譜柱 (4. 6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～21 min，14%A；21～37 min，14%A→39%A；37～42 min，40%A→52%A；42～96 min，52%A→80%A；96～105 min，80%A→95%A)；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取適量蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、1′-表-三白草酮、saurucinolⅠ、(-)-三白草醇甲基醚、三白草酮、三白草醇、里卡靈A、4-O-去甲基馬納薩亭B、里卡靈B、馬納薩亭B，加入10 mL容量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為蘆丁21.54 μg/mL、金絲桃苷35.46 μg/mL、槲皮苷41.36 μg/mL、馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ 45.67 μg/mL、1′-表-三白草酮49.28 μg/mL、(-)-三白草醇甲基醚67.58 μg/mL、三白草酮179.04 μg/mL、三白草醇52.80 μg/mL、saurucinolⅠ26.27 μg/mL、里卡靈A 80.67 μg/mL、4-O-去甲基馬納薩亭B 80.48 μg/mL、里卡靈B 67.04 μg/mL、馬納薩亭B 122.08 μg/mL的混合對(duì)照品甲醇溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取三白草樣品粉末(過4號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取S1供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。以3號(hào)峰槲皮苷為參照峰，計(jì)算得1～20號(hào)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均<3%，用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算各色譜指紋圖譜的相似度均>0.990，表明儀器穩(wěn)定，精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批三白草樣品(S1)，共6份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。以3號(hào)峰槲皮苷為參照峰，計(jì)算得1～20號(hào)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均<3%，用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算各色譜指紋圖譜的相似度均>0.990，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、18、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。以3號(hào)峰槲皮苷為參照峰，計(jì)算得1～20號(hào)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均<3%，用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算各色譜指紋圖譜的相似度均>0.990，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 三白草樣品對(duì)照指紋圖譜的建立與分析評(píng)價(jià)

2.4.1 三白草樣品圖譜采集和對(duì)照指紋圖譜的建立 將15批三白草藥材按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)并記錄各批次的色譜圖，得到15批藥材的疊加指紋圖譜，見圖1。將所得三白草HPLC色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004版)”，將樣品S1的圖譜設(shè)為參照?qǐng)D譜，選擇中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，時(shí)間窗寬度設(shè)定為0.1 min，對(duì)15批藥材的指紋圖譜進(jìn)行多點(diǎn)校正后進(jìn)行峰匹配，生成三白草藥材指紋圖譜的共有模式并標(biāo)定20個(gè)共有峰，共有模式指紋圖譜見圖2。

S1～S15.表1中S1～S15；R.共有模式指紋圖譜

圖115批三白草藥材HPLC指紋圖譜疊加圖

Figure1HPLC fingerprints of 15 batches ofSaururuschinensis(Lour.) Baill.

1.蘆丁； 2.金絲桃苷； 3.槲皮苷； 6.馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ； 10. 1′-表-三白草酮； 13.(-)-三白草醇甲基醚； 14.三白草酮； 15.三白草醇； 16.saurucinolⅠ; 17.里卡靈A； 18. 4-O-去甲基馬納薩亭B； 19.里卡靈B； 20.馬納薩亭B。

圖2三白草藥材共有模式指紋圖譜(A)和混合對(duì)照品溶液指紋圖譜(B)

Figure2HPLC fingerprints of common model (A) and mixed reference solution (B) ofSaururuschinensis(Lour.) Baill.

2.4.2 指標(biāo)性成分的指認(rèn) 按“2. 2”項(xiàng)下方法配置對(duì)照品溶液進(jìn)行分析測(cè)定，其中3號(hào)峰槲皮苷峰面積適中、保留時(shí)間適宜，故選為參照峰S。以3號(hào)峰為參照峰，確定了20個(gè)共有峰為特征峰。將混合對(duì)照品溶液以相同條件進(jìn)樣測(cè)定，與共有模式圖譜進(jìn)行比較，根據(jù)保留時(shí)間，結(jié)合紫外全波長(zhǎng)掃描圖，指認(rèn)出圖譜中13個(gè)色譜峰，分別為蘆丁(1號(hào)峰)、金絲桃苷(2號(hào)峰)、槲皮苷(3號(hào)峰)、馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ(6號(hào)峰)、1′ -表-三白草酮(10號(hào)峰)、 (-)-三白草醇甲基醚(13號(hào)峰)、三白草酮(14號(hào)峰)、三白草醇(15號(hào)峰)、saurucinolⅠ(16號(hào)峰)、里卡靈A(17號(hào)峰)、4-O-去甲基馬納薩亭B(18號(hào)峰)、里卡靈B(19號(hào)峰)、馬納薩亭B(20號(hào)峰)，共有峰相對(duì)保留時(shí)間與峰面積見表2～表3。

表2 15批三白草藥材相對(duì)保留時(shí)間Table 2 Relative retention time of common peaks of 15 batches of Saururus chinensis (Lour.) Baill.

表3 15批三白草藥材相對(duì)峰面積Table 3 Relative peak area of common peaks of 15 batches of Saururus chinensis (Lour.) Baill.

2.4.3 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004版)”軟件，對(duì)15批三白草藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)和數(shù)據(jù)匹配。以生成的共有模式圖譜作為對(duì)照，各15批藥材圖譜相似度均大于0.9，表明15批三白草藥材的成分穩(wěn)定，結(jié)果見表4。

表415批三白草藥材的相似度

Table4The similarity of 15 batches ofSaururuschinensis(Lour.) Baill.

編號(hào)相似度編號(hào)相似度S10.974S90.964S20.908S100.943S30.955S110.972S40.953S120.971S50.990S130.964S60.990S140.987S70.990S150.959S80.982

2.4.4 系統(tǒng)聚類分析 將15批三白草樣品的HPLC指紋圖譜中20個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS22.1統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐式平方距離對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。第一類為S3、S4、S5、S6、S9、S12、S14、S15，各個(gè)批次的樣品相似度較高(0.953～0.990)；第二類為S2、S10，各個(gè)批次相似度較低(0.908～0.943)；第三類為S1、S7、S8、S11、S13，各個(gè)批次的樣品相似度最為接近(0.964～0.990)。這與指紋圖譜的相似度分析結(jié)果基本一致。

圖315批三白草藥材的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

Figure3Dendrogram of clustering analysis of 15 batches ofSaururuschinensis(Lour.) Baill.

3 討論

本試驗(yàn)考察了超聲、回流2種提取方法提取效果，結(jié)果表明回流所得各色譜峰面積較大，峰型較好、峰高較高，故選擇回流提取作為提取方法。采用甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸等不同洗脫系統(tǒng)進(jìn)行比較和考察。結(jié)果表明，用甲醇-水洗脫，所得圖譜中峰信息較多、峰型較好、分離度佳，故選擇甲醇-水作為洗脫流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了5個(gè)不同波長(zhǎng)下的吸收?qǐng)D譜，包括238、256、280、320和360 nm。相較之下，在238 nm波長(zhǎng)下所得的色譜圖峰信息較多、峰型較好，基線相對(duì)較平穩(wěn)，故選擇238 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究采用HPLC-PDA法建立了三白草藥材的指紋圖譜，以3號(hào)峰為參照，確定了20個(gè)共有峰為特征峰，并且指認(rèn)了指紋圖譜中13種已知成分，其中1號(hào)峰為蘆丁、2號(hào)峰為金絲桃苷、3號(hào)峰為槲皮苷、6號(hào)峰為馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、10號(hào)峰為1′ -表-三白草酮、13號(hào)峰為(-)-三白草醇甲基醚、14號(hào)峰為三白草酮、15號(hào)峰為三白草醇、16號(hào)峰為saurucinolⅠ、17號(hào)峰為里卡靈A、18號(hào)峰為4-O-去甲基馬納薩亭B、19號(hào)峰為里卡靈B、20號(hào)峰為馬納薩亭B。三白草指紋圖譜中共有峰的保留時(shí)間差別較小，但峰面積差異較大，說明不同產(chǎn)地的同一化學(xué)成分的量有差別。采用相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)不同產(chǎn)地的藥材進(jìn)行比較分析，得出15批三白草藥材指紋圖譜與共有模式比較相似度為0.908～0.990，除S2、S10號(hào)樣品外，其余13批不同產(chǎn)地的三白草樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.95，表明不同產(chǎn)地的三白草質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。