徐 悅，鄭永強，付蓓蓓

（湖北省十堰市人民醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 十堰 442000）

腦缺血再灌注會導(dǎo)致局部缺血腦組織功能損害，其損害程度與缺血時間長短及殘存血流量有關(guān)，短期不完全性缺血引起可逆性損害，而長期完全缺血或嚴重缺血會引起梗死[1-3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞表面和細胞外蛋白質(zhì)的合成、加工和轉(zhuǎn)運的主要場所，當未折疊蛋白聚集及Ca2+平衡紊亂時，將發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡[4-5]。自噬基因 Beclin1，Parkin，PINK1 是細胞凋亡調(diào)節(jié)因子[6]。復(fù)方腦肽節(jié)苷脂具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝等多種作用，能通過抑制缺血區(qū)苯二氮 受體的表達，減少半暗區(qū)面積，從而發(fā)揮對缺血腦組織的保護作用[7]。本研究中探討了復(fù)方腦肽節(jié)苷脂對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用及對Beclin1，Parkin和PINK1表達的影響，為腦缺血再灌注損傷的臨床治療提供了理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：清潔級 SD大鼠 120只，12周齡，體質(zhì)量（109.76 ± 11.03）g，雌雄兼半，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)20090001]，大鼠自由攝食及飲水，自動控制晝夜循環(huán)（12 ／12 h），室溫（22 ±1）℃。每周稱體質(zhì)量 1 次，每周調(diào)換籠位1次，符合《實驗動物管理條例》要求。

儀器：MK3型酶標儀（美國熱電公司）；ABI7500型熒光聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）。

試藥：復(fù)方腦肽節(jié)苷脂注射液（吉林步長制藥有限公司，國藥準字 H22026472，規(guī)格為每支2 mL）；銀杏葉提取物注射液（金納多，臺灣濟生化學(xué)制藥廠股份有限公司，規(guī)格為每支 5 mL ∶17.5 mg）；Beclin1，Parkin，PINK1酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒(批號為KIT10154-2，KIT10416-7，KIT10575-1)，均購自南京金益柏生物科技有限公司；Beclin1，Parkin，PINK1一抗、二抗均購自武漢伊艾博科技有限公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；miRNeasy Mini試劑盒購自美國Qiagen公司；水為蒸餾水。

1.2 方法

建模與分組、給藥：將120只SD大鼠隨機分為6組，即假手術(shù)組（A組，等體積0.9%氯化鈉注射液），模型組（B組，等體積0.9%氯化鈉注射液），金納多組（C組，50 mg ／kg）與復(fù)方腦肽節(jié)苷脂低、中、高劑量組（D1，D2，D3，2，4，8 mg ／kg）。B 組、C 組、D1組、D2組、D3組大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后，結(jié)扎頸外動脈遠端，在頸外動脈上切開1個小口，將1條尼龍線（直徑0.25 mm，尖端涂抹硅膠）插入頸內(nèi)動脈至20 mm，并結(jié)扎，4 h后，將線栓輕輕拉出，以建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型。A組只切開皮膚和分離血管，不進行阻塞血流。術(shù)后給予大鼠20萬U青霉素肌肉注射，連續(xù)使用3 d。建模成功后各組大鼠腹腔注射相應(yīng)藥物，每天1次，持續(xù)14 d，根據(jù)成人劑量公式相應(yīng)換算，大鼠用藥量為成人的6.24倍，將注射液溶于蒸餾水，以20.0 mL／kg劑量腹腔注射，配制藥液質(zhì)量濃度為10.0 g／mL。

神經(jīng)功能缺損評分：分別于給藥7，14 d時，根據(jù)Bederson JB評分法[8]進行神經(jīng)功能缺損評分，包括運動、感覺、反射和平衡能力測試等。

貼紙去除及平衡木行走試驗：給藥14 d時，依據(jù)相關(guān)文獻[9]方法進行。

Beclin1，Parkin，PINK1 mRNA 水平檢測：給藥 14 d后，處死大鼠，以逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測Beclin1，Parkin，PINK1 mRNA的表達水平。大鼠腦組織樣品中提取總RNA，合成cDNA，以 β-actin引物為內(nèi)參。PCR條件：95℃持續(xù) 10 min，40個循環(huán)，持續(xù) 15 s，溫度 60 ℃ 。使用 SDS 2.0.1 軟件（Applied Biosystems）計算循環(huán)閾值（Ct）值。

Beclin1，Parkin，PINK1蛋白水平檢測：稱取大鼠缺血腦組織，制成勻漿，收集上清液，以ELISA法檢測Beclin1，Parkin，PINK1 蛋白水平。

Beclin1，Parkin，PINK1蛋白表達水平觀察：制作常規(guī)大鼠缺血腦組織石蠟切片，使用常規(guī)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法進行免疫組化染色，將組織列切片用二甲苯脫蠟，通過梯度乙醇脫水浸入含有0.3%過氧化氫的甲醇中20 min，將切片浸入pH 6的檸檬酸鹽緩沖液中，并在800 W微波爐中加熱10 min進行實現(xiàn)抗原修復(fù)。以抗生物素蛋白／生物素結(jié)合阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，1% 的 Beclin1，Parkin，PINK1抗體工作液(1∶200，V／V)4℃孵育過夜（加鏈霉菌抗生物素蛋白）。3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染后封片，以乙醇脫水，以二甲苯澄清。隨機選擇10個高倍（400倍）視野，按陽性細胞數(shù)量及著色強度進行計分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；同時計數(shù)；陽性細胞＞50%為（+++），26% ～50%為（++），6% ～25%為（+），≤5%為（-），（-）及（+）歸為不表達或低表達，即為陰性，（++）及（+++）歸為高表達，即為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以 X±s表示，行 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)運動功能評分

結(jié)果見表1。與A組比較，B組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高(P＜0.05)；與 B組比較，C組與 D1組、D2組、D3組大鼠給藥7 d及14 d時神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P＜0.05)，且與復(fù)方腦肽節(jié)苷脂給藥劑量呈負相關(guān)。

2.2 雙側(cè)貼紙去除時間和平衡木過桿時間

結(jié)果見表1。與A組比較，B組大鼠雙側(cè)貼紙去除時間、平衡木過桿時間均顯著延長(P＜0.05)；與B組比較，C組與D1組、D2組、D3組雙側(cè)貼紙去除時間、平衡木過桿時間均顯著縮短(P＜0.05)，且與復(fù)方腦肽節(jié)苷脂給藥劑量呈負相關(guān)。

2.3 Beclin1 mRNA，Parkin mRNA，PINK1 mRNA 表達水平

結(jié)果見表1。與A組比較，B組大鼠腦組織Beclin1 mRNA和PINK1 mRNA表達水平均顯著降低，Parkin mRNA表達水平顯著升高；與B組比較，C組與D1組、D2組、D3組大鼠腦組織Beclin1和PINK1 mRNA表達水平均顯著升高，Parkin mRNA水平顯著降低（P＜0.05），且隨著復(fù)方腦肽節(jié)苷脂給藥劑量的增加，Beclin1和PINK1 mRNA表達水平逐漸升高，Parkin mRNA表達水平逐漸降低。

2.4 Beclin1，Parkin，PINK1 蛋白表達水平

結(jié)果見表1和圖1。與A組比較，B組大鼠腦組織Beclin1和PINK1蛋白表達水平均顯著降低，Parkin蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C組與D1組、D2組、D3組大鼠腦組織 Beclin1和 PINK1蛋白表達水平均顯著升高，Parkin蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），且隨著復(fù)方腦肽節(jié)苷脂給藥劑量的增加，Beclin1和PINK1蛋白表達水平均逐漸升高，Parkin蛋白水平逐漸降低。Beclin1，Parkin，PINK1陽性表達為棕褐色，各組Beclin1，Parkin，PINK1陽性表達情況與各蛋白表達水平相符。

表1 各組大鼠觀察指標比較（X±s，n＝20）

圖1 復(fù)方腦肽節(jié)苷脂對模型大鼠自噬基因表達的影響(×400)

3 討論

Parkin和PINK1是調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞凋亡的重要調(diào)控因子，PINK1是抑制細胞凋亡蛋白，Parkin是促細胞凋亡蛋白[10-11]。細胞中，當Parkin表達水平較高時，PINK1與Parkin通過磷酸二酯脫氫鍵形成同源二聚體PINK1／Parkin，促進細胞凋亡，PINK1表達水平較高時則通過氫鍵形成異源二聚體PINK1／Parkin，抑制細胞凋亡[12-14]。Beclin1是調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)介導(dǎo)的細胞凋亡的保護主要因素。Beclin1可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性，來阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細胞凋亡過程[15]。

復(fù)方腦肽節(jié)苷脂能促進缺血腦組織的新陳代謝，參與缺血腦組織神經(jīng)細胞生長、分化和再生過程，具有抗細胞凋亡作用。復(fù)方腦肽節(jié)苷脂可能通過降低核因子-κB（NF-κB）活性及調(diào)節(jié)其表達而起到抗凋亡作用[16]。此外，復(fù)方腦肽節(jié)苷脂可以增強過氧化物酶-6的表達，從而減少缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少神經(jīng)細胞凋亡，達到保護神經(jīng)細胞的目的。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方腦肽節(jié)苷脂能明顯改善腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經(jīng)功能、感覺及運動功能，高劑量效果尤為明顯；能促進腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織Beclin1及PINK1表達，抑制Parkin表達，進而抑制神經(jīng)細胞凋亡。

綜上所述，復(fù)方腦肽節(jié)苷脂對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用較好，能明顯改善其神經(jīng)功能、感覺及運動功能，其機制與復(fù)方腦肽節(jié)苷脂能促進Beclin1 mRNA，PINK1 mRNA及蛋白的表達，抑制Parkin mRNA及蛋白的表達，進而抑制神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。