邱楚群 ，梁美婷 ，江文菁 ，吳海游 ，呂思敏 ，吳 鐵 ，

（1.廣東醫(yī)科大學中藥與新藥研究所，廣東 東莞 523808； 2.廣東醫(yī)科大學-廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯(lián)合研究中心，廣東 東莞 523808）

輔酶Q10又名泛醌，為廣泛存在于生物體內(nèi)的脂溶性醌環(huán)類化合物，可直接清除自由基以起到減輕氧化應激和穩(wěn)定生物膜的作用[1]，可協(xié)同體內(nèi)的抗氧化物增強抗氧化作用，可通過抑制線粒體通透性和促進三磷酸腺苷（ATP）的生成抑制細胞凋亡[2]，還可促進淋巴細胞增殖和轉化而增強免疫[3-4]。Q伴侶為新型營養(yǎng)液，可增強輔酶Q10對皮膚的保護作用，主要成分為?；撬?、硫辛酸等。?；撬釣橐杂坞x氨基酸形式存在于動物體內(nèi)的含硫 β-氨基酸，具有增強免疫功能、細胞膜的抗氧化能力、心臟收縮能力，保護心血管系統(tǒng)和維持視覺功能等廣泛的生物學作用[5]。硫辛酸是由線粒體產(chǎn)生的含有二硫鍵的抗氧化劑，主要存在于心臟、肝臟和腎臟中，雙硫封閉環(huán)狀的化學結構使其具有較高的電子密度和親電子性，因而具有較強的抗氧化能力，臨床主要用于治療糖尿病、帕金森綜合征、心臟病、風濕病等疾病[6]。隨著年齡的增長，機體抗氧化能力下降，抗氧化系統(tǒng)失衡，外源性補充輔酶Q10可提高機體清除自由基的能力，但輔酶Q10聯(lián)合Q伴侶是否對損傷皮膚有改善作用尚不明確。本研究中觀察了輔酶Q10聯(lián)合Q伴侶對模型大鼠皮膚氧化損傷的改善作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：清潔級SD健康大鼠32只，雄性，3月齡，體質(zhì)量(277.93±31.18)g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號為 SCXK（粵）2011-0015。實驗期間大鼠自由飲水和進食，且實驗方案已得到學校實驗動物倫理委員會批準。

儀器：手動勻漿器（四川蜀牛玻璃儀器有限公司，規(guī)格為100 mL）；5810R型高速冷凍離心機，G25005型酶標儀(德國 Eppendorf公司)；B00141型手搖式切片機（上海醫(yī)療器械四廠）；MGC30型光學顯微鏡及顯微照相機（德國Leica公司）。

試藥：輔酶Q10（廣東潤和生物科技有限公司，批號為16012120，以小麥胚芽油為溶劑，配成每100 mL含輔酶Q101 g的受試物供試品溶液）；Q伴侶（由本研究室根據(jù)本項目前期申報的發(fā)明專利配方配制，專利申請?zhí)枮?201610184057.0）。

1.2 方法

建模與分組、給藥：將32只SD大鼠隨機分為空白對照組（A組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（B組，等體積 0.9% 氯化鈉溶液）、輔酶 Q10組（C 組，3 mL ／kg）、輔酶 Q10聯(lián)合 Q 伴侶組（D 組，3 mL ／kg+3 mL ／kg），各8 只。B組、C組、D組大鼠皮下注射 D-半乳糖（150mg／kg），每天1次，連續(xù)14 d，以建立皮膚氧化損傷模型[7-8]；A組大鼠皮下注射 0.9%氯化鈉注射液（150 mg／kg）；同時各組大鼠灌胃相應藥物，每天1次，連續(xù)14 d。

組織病理形態(tài)學觀察與表皮厚度測定：建模成功后，取0.5 cm×0.5 cm大鼠皮膚組織于10%中性甲醛液中固定，脫水后進行石蠟包埋，切片厚度5 μm，脫蠟，蘇木素-伊紅（HE）染色，苦味酸酸性復紅（VG）染色，封片。在光學鏡顯微鏡下觀察病理形態(tài)學，以Image-Pro Plus 6.0軟件測定表皮厚度。

生化指標測定：參照試劑盒說明書[9]測定大鼠皮膚組織勻漿中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平[9]，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1）mRNA表達水平測定：采用聚合酶鏈式反應法。取大鼠皮膚組織，勻漿。Trizol法提取 RNA，鑒定完RNA純度和完整性后，反轉錄制備cDNA；PCR反應條件為，預變性95℃，10 min；95℃變性 15 s，60℃退火 60 s，循環(huán) 40次；60℃→90℃，每15 s升溫 0.3℃。GADPH上游引物為 CACTCCCTTGGACTCACTCATT（5′-3′）， 下 游 引 物 為 TGTGGTGTTGTTGCACCTGTT（5′-3′）； MMP-1 上 游 引 物 為TTCCTACCCCCAATGTATCCG（5′-3′）， 下 游 引 物 為CATGAGGTCCACCACCCTGTT（5′-3′）。PCR 反應結束后，定量分析PCR獲得的熔解曲線和擴增曲線結果的可靠性，并設定循環(huán)閾值（Ct），以 MMP-1／GADPH 比值分別代表相對表達水平，2-ΔΔCt法計算MMP-1的相對表達水平。各組設3個復孔，重復3次。

DNA甲基轉移酶（DNMT1）蛋白表達水平測定：采用Western blot法。取大鼠皮膚組織，加入1 mL RIPA蛋白裂解液，冰上勻漿，每隔5 min超聲20 s，檢測蛋白含量。以10%SDS-PAGE電泳后濕法電轉，加入一抗，4℃ 孵育過夜，回收一抗，清洗3次，加入二抗，室溫振搖1 h，回收二抗，清洗3次，加入ECL化學發(fā)光試劑，顯影、定影、清洗。用Image J軟件將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為蛋白相對表達量[10]。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以 X±s表示，行 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠皮膚病理形態(tài)學

A組大鼠皮膚角質(zhì)層無脫落，膠原纖維排列均勻整齊；B組大鼠皮膚表皮厚度明顯變薄，角質(zhì)層飄起脫落，膠原纖維變粗斷裂，排列紊亂；C組大鼠表皮厚度有所增加，角質(zhì)層無脫落，膠原纖維排列整齊，且大小良好；D組大鼠表皮厚度明顯增加，角質(zhì)層無脫落，膠原纖維排列整齊，粗細均勻。詳見圖1。

圖1 各組大鼠皮膚組織病理形態(tài)學（×200）

2.2 其他觀察指標

結果見表1、圖2至圖4。

表1 大鼠皮膚組織勻漿中生化指標水平比較（X±s，n＝8）

注：與 A 組比較， P ＜0.05；與 B 組比較，#P ＜0.05。

圖2 各組大鼠皮膚的表皮厚度

圖3 各組大鼠皮膚組織勻漿中MMP-1表達水平

圖4 各組大鼠皮膚組織勻漿中DNMT1表達水平

3 討論

本研究中采用 D-半乳糖皮下注射建立大鼠皮膚氧化損傷模型，皮膚的氧化損傷是由機體自由基（如MDA）過多造成的，正常情況下機體的抗氧化系統(tǒng)可以清除、轉化過多的自由基，但由于機體受到外部刺激，自由基數(shù)量會成倍增加，造成抗氧化系統(tǒng)負擔過重，無法快速地清除自由基，同時過多自由基也會攻擊機體的氧化酶（如SOD，GSH-Px），導致氧化酶的活性下降，形成惡性循環(huán)[11-12]。D-半乳糖是由半乳糖氧化酶所代謝生成的半乳糖醛，半乳糖醛無法進一步代謝，這使得細胞內(nèi)的滲透壓升高，并產(chǎn)生大量自由基，造成大鼠皮膚氧化損傷[13]。模型組大鼠機體產(chǎn)生大量MDA，同時SOD及GSH-Px的活性減弱，造成大鼠機體的抗氧化系統(tǒng)失衡，導致皮膚組織的MMP-1表達水平升高與DNMT1表達水平降低，表皮厚度增加，纖維排列紊亂，皮膚出現(xiàn)氧化損傷情況。另一方面，D-半乳糖少量還以游離態(tài)形式存在于乳汁中，并與葡萄糖結合構成乳糖，對嬰幼兒的生長發(fā)育可起到促進作用，但當大劑量食用D-半乳糖會產(chǎn)生嚴重的不良反應，這一點與 D-半乳糖造成皮膚氧化損傷的原理一致[14]，故 D-半乳糖是把“雙刃劍”。

輔酶Q10為機體抗氧化劑和非特異性免疫增強劑，可清除機體MDA等自由基，維護機體抗氧化系統(tǒng)平衡，改善氧化應激狀態(tài)，起到抗氧化損傷作用[15-16]。體內(nèi)輔酶Q10的水平與皮膚活性氧簇（ROS）的產(chǎn)生量呈負相關，當輔酶Q10含量下降到正常值的30%～50%時，皮膚組織中的ROS含量則明顯增加，輔酶Q10的含量與ROS的產(chǎn)生增多和細胞死亡存在一定的相關性[17-18]。C組大鼠癥狀明顯比B組大鼠輕，這是由于輔酶Q10可以維護機體的抗氧化系統(tǒng)平衡，同時清除機體過多的自由基，緩解氧化應激狀態(tài)。Q伴侶主要含牛磺酸、硫辛酸，首先，?；撬峥梢种扑矔r受體點位TRPM2的激活，減少氧化應激，還可通過羧-氨反應減少醛類所造成的細胞損傷，也能通過抑制Caspase-3 mRNA的表達，起到抗氧化抗衰老的作用[19]。其次，硫辛酸和輔酶Q10的混合劑能對抗運動所引起的疲勞[20]，硫辛酸不僅可清除自由基和再生體內(nèi)的抗氧化劑，還可通過還原PMSR，使其參與到生物大分子的殘基修復過程中，維持機體的穩(wěn)定[6]，因此Q伴侶與輔酶Q10起到了協(xié)同作用。

綜上所述，輔酶Q10聯(lián)合Q伴侶對模型大鼠皮膚氧化損傷有一定改善作用，其機制與抗氧化有關。參考文獻：

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