陳 星 ，夏曉冬 ，童德銀 ，車道標(biāo) ，2

（1.江蘇省宿遷市第一人民醫(yī)院，江蘇 宿遷 223800； 2.江蘇省人民醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

肝纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與活化的肝星狀細(xì)胞沉積細(xì)胞外基質(zhì)有密切關(guān)系[1-2]。肝星狀細(xì)胞活化過(guò)程中產(chǎn)生大量的促炎因子、趨化因子和分子，許多炎性因子在肝星狀細(xì)胞的活化中起著關(guān)鍵作用，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素 6（IL-6）[3]。此外，核因子κB（NF-κB）、活性氧、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物和多種生長(zhǎng)因子也促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖，與增加的肌成纖維細(xì)胞共同作用，最終導(dǎo)致肝纖維化的多種信號(hào)通路的病理生理改變。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）等分子靶標(biāo)在肝臟纖維化中具有重要意義。TGF-β是生長(zhǎng)因子基因超家族中特征性細(xì)胞因子[4-5]，分布廣泛，被認(rèn)為是強(qiáng)有力的促纖維化介質(zhì)，可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積，從而導(dǎo)致肝纖維化[6]。同時(shí)，TGF-β與肝硬化的發(fā)展密切相關(guān)，可刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生并消除基質(zhì)蛋白的去除現(xiàn)象[7-9]。芒果苷是芒果葉的主要成分，是一種四羥基吡酮的碳糖苷，屬雙苯吡酮類化合物，具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)等多種藥理特性[10]。本研究中探討了芒果苷對(duì)四氯化碳肝損傷模型小鼠的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試藥

動(dòng)物：無(wú)菌級(jí)ICR小鼠50只，雄性，8～12周，購(gòu)自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（滬）2008-0016。所有動(dòng)物于室溫（22 ± 1）℃，空氣相對(duì)濕度40% ～50%，晝夜交替12 h，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

儀器：UV-3200S型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本 Olympus公司）；DYCZ-24KS型電泳儀（北京六一儀器廠）。

試藥：芒果苷（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為111607-200301）；所有抗體均購(gòu)自 Cell Signaling Technology；TNF-α，IL-6，IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為 20060922，20060925，20060926），均購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)公司；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（批號(hào)分別為20160514，20161157）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅染液（HE，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

分組、給藥與建模：將50只ICR小鼠隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組（A組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（B組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、水飛薊素組（C組，0.1 g／kg）和芒果苷低、高劑量組（D1組、D2組，20，40 mg／kg），各10只。上述后4組小鼠皮下注射四氯化碳 -橄欖油（1 ∶1，V／V)，3 mL／kg，每周 2 次，連續(xù)6周，以建立小鼠肝纖維化模型?？瞻讓?duì)照組小鼠皮下注射等量橄欖油。建模成功后，各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)6周。

肝臟組織病理學(xué)檢查：小鼠眼眶取血后處死，將肝臟組織固定于4%中性福爾馬林溶液中過(guò)夜。將組織固定包埋于石蠟中，切成4 mm厚的切片。然后去石蠟，HE染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察肝臟病理改變情況。

AST和ALT活性檢測(cè)：采用干化學(xué)法和全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清AST和ALT活性，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書步驟操作。

TNF-α，IL-1β，IL-6含量檢測(cè)：采用 ELISA 法檢測(cè)小鼠血清 TNF-α，IL-1β，IL-6含量。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書步驟操作。

炎性相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平檢測(cè)：采用Western blot法檢測(cè)。將小鼠肝組織剪碎，取50 mg，加1 mL RIPA裂解液提取總蛋白，12 000 r／min離心15 min，收集上清液，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各組取20 μg上樣，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST清洗3次，加入一抗，4℃ 孵育過(guò)夜，回收一抗，TBST清洗4次，加入二抗，室溫振搖2 h，回收二抗，TBST清洗4次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，將PVDF膜放入暗盒中，壓上X膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。然后，通過(guò)Image J軟件將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以 X±s表示，行 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

A組小鼠肝臟中央靜脈和周圍肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。B組小鼠肝組織細(xì)胞存在氣球樣變性和脂肪變化，上述氣球樣變性和脂肪變化與纖維結(jié)締組織鏈和嚴(yán)重炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)。C組和D1組、D2組上述肝組織病理形態(tài)學(xué)均有不同程度改善。詳見圖1。

2.2 其他觀察指標(biāo)

結(jié)果見表1和圖2。與A組比較，B組小鼠肝組織勻漿中正Nod樣受體蛋白3（NLRP3），凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC），含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 1（Caspase-1），IL-1β，p-P65，P65，核因子 κB 抑制因子 α（IκBα），TGF- β，p-Samd-3，Smad-3 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與 B組比較，C組和D1組、D2組小鼠肝組織勻漿中蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P ＜0.01）。

3 討論

圖1 肝組織病理形態(tài)學(xué)（×200）

表1 各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性和炎性因子水平比較（X ±s，n＝10）

圖2 肝組織勻漿中相關(guān)炎性因子蛋白表達(dá)

抑制炎癥相關(guān)途徑是治療肝纖維化的有效靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，芒果苷可通過(guò)抑制 NLRP3，ASC，Caspase-1的表達(dá)，降低 p-P65和p-IκBα的生成，抑制TGF-β和p-Samd-3在肝組織中的表達(dá)，從而抑制NLRP3炎癥小體反應(yīng)。四氯化碳已被廣泛用于實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)肝纖維化[11-12]，其產(chǎn)生過(guò)量自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，隨后釋放炎性細(xì)胞因子和損傷肝細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，20 mg／kg和40 mg／kg芒果苷能顯著改善模型小鼠ALT、AST、炎性細(xì)胞因子水平和肝組織病理形態(tài)等。

炎性過(guò)程為涉及成纖維過(guò)程的主要事件[13]。肝臟損傷時(shí)，肝巨噬細(xì)胞可激活NF-κB及其下游信號(hào)傳導(dǎo)。NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)多種炎性細(xì)胞因子的釋放，包括 TNF-α，IL-6，IL-1β。TNF-α，IL-6，IL-1β，進(jìn)一步維持炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，四氯化碳可增加小鼠血清 TNF-α，IL-6，IL-1β含量，升高p-IκBα表達(dá)水平，從而加重肝臟炎癥和纖維化[14]。20 mg／kg和 40 mg／kg芒果苷能顯著降低模型小鼠TNF-α，IL-6，IL-1β 的水平，對(duì) NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也有明顯的抑制作用。

TGF-β可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積累，導(dǎo)致肝纖維化，其過(guò)量產(chǎn)生會(huì)刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的各種成分的合成和釋放。一旦激活，TGF-β結(jié)合到Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸／蘇氨酸激酶受體，將激活受體調(diào)節(jié)的SMAS，包括Smad-3。活化Smads的核易位是操縱TGF-β依賴基因的基本過(guò)程。TGF-β／Smad信號(hào)通路失活可能是抗肝纖維化的一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，在四氯化碳處理的小鼠中，TGF-β和Smad-3磷酸的表達(dá)水平升高，20mg／kg和 40 mg／kg芒果苷可顯著抑制Smad-3和TGF-β的磷酸化。

綜上所述，芒果苷對(duì)肝損傷模型小鼠具有一定改善作用，其機(jī)制與降低炎性反應(yīng)有關(guān)。參考文獻(xiàn)：

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