程開勇，毛維興，徐秉良，劉永紅，郭耀霞，陳 晶，張 祿，張樹武

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

木霉菌(Trichodermaspp.) 是一類自然界中分布較為廣泛的生防真菌，且為土壤微生物的重要群落之一，其常見于土壤、植物殘體、植物根圍和葉圍等環(huán)境中[1-2]。有報道，木霉菌不僅具有廣譜的抗菌活性，而且具有促進(jìn)植物發(fā)芽、生長和開花等作用[3-6]。因此，利用木霉菌開發(fā)安全高效的生物農(nóng)藥具有良好的發(fā)展前景。然而，在自然條件下木霉菌的生長容易受到各種不良環(huán)境因子的影響，如土壤成分、光照、極端溫度、濕度及化學(xué)殺菌劑等因素[7]。因此，提高木霉菌的生長能力對發(fā)揮其生防功能具有重要意義。前期已有相關(guān)學(xué)者對影響木霉菌生長的因素做了相關(guān)研究，王芊[8]研究了不同光照、溫度、碳源、氮源和化學(xué)殺菌劑對木霉菌菌絲生長的影響，明確了木霉菌生長的最適溫度范圍和最佳光照條件等因素，但微波和紫外誘變對木霉菌生長速率和菌絲生長量影響的研究較少。

微波是一種高頻率的電磁波，利用微波進(jìn)行誘變具有設(shè)備簡單、操作簡便、安全可靠和正突變率高的特點[9-10]。同時，紫外照射是一種簡便、實用、效果好和值得推廣的誘變方式[11]。因此，采用微波誘變和紫外誘變方法測定其對木霉菌T-YS生長的影響，并篩選最佳誘變條件，旨在提高木霉菌生長速率和生長量，為提高木霉菌的生防活力和應(yīng)用范圍提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

木霉T-YS菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實驗室篩選并保存。采用PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL；PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 分生孢子懸浮液制備 將分離保存的木霉T-YS菌株接種于PDA平板活化培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d，待產(chǎn)生大量綠色分生孢子后，加入1滴吐溫-80(Tween-80)和5 mL無菌水，充分振蕩使分生孢子脫落于無菌水中。然后，加入無菌水稀釋至200倍液，并利用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)孢子懸浮液的濃度，配制最終濃度為1×106cfu/mL分生孢子懸浮液，備用。

1.2.2 微波誘變處理 在經(jīng)滅菌處理的1.5 mL離心管中加入1 mL配制好的木霉T-YS菌株分生孢子懸浮液(1×106cfu/mL)，然后置于700 W格蘭仕T770D20T-TD(W0)型微波爐中分別處理15、30、45、60和75 s，并采用冰浴法消除熱效應(yīng)，每隔15 s取出1次，放在冰塊上冷卻5 s。試驗以未經(jīng)微波誘變處理的菌株作為對照。然后，分別吸取各處理和對照分生孢子懸浮液200 μL均勻涂布于PDA平板，待晾干后置于25℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)接于PDA平板進(jìn)行菌落生長量測定。試驗過程中各個處理和對照均重復(fù)3次。

1.2.3 紫外誘變處理 吸取配制好的木霉T-YS菌株分生孢子懸浮液(1×106cfu/mL)200 μL，并均勻涂布于PDA平板待紫外誘變處理。誘變處理前先打開紫外燈(10 W)預(yù)熱30 min，使其功率穩(wěn)定。然后，將涂有分生孢子懸浮液的PDA平板去蓋并置于紫外燈下照射，照射距離為10 cm，分別處理0.5、1、3、5和7 min，并以未經(jīng)紫外誘變處理的菌株作為對照。處理后立即蓋上蓋子置于25℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后將其轉(zhuǎn)接于空白PDA平板進(jìn)行菌落生長量測定。試驗過程中各個處理和對照均重復(fù)3次。

1.2.4 誘變對木霉T-YS菌株菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響 將經(jīng)微波誘變和紫外誘變的木霉T-YS菌株在PDA平板培養(yǎng)3 d后，利用經(jīng)滅菌處理的打孔器(Ф=5 mm) 在菌落邊緣打取菌餅，并將其轉(zhuǎn)接于新的PDA平板，25℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)1 d后采用“十字交叉法”測量菌落直徑，每隔1 d測定1次，并以原始菌株(未誘變菌株)作為對照，每個處理和對照均重復(fù)3次。同時，培養(yǎng)5 d后在PDA平板上加入1滴吐溫-80(Tween-80)和5 mL無菌水充分振蕩，并使其分生孢子脫落在無菌水中，即得到分生孢子懸浮液的原液，并利用血球計數(shù)板計算其產(chǎn)孢量。

1.2.5 誘變對木霉T-YS菌株菌絲干重的影響 將經(jīng)微波誘變和紫外誘變的木霉T-YS菌株分別配制成濃度為1×106cfu/mL的孢子懸浮液，并吸取1 mL孢子懸浮液接種于30 mL PDB液體培養(yǎng)基中，置于150 r/min恒溫?fù)u床25℃振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d后發(fā)酵液經(jīng)無菌濾紙過濾，過濾后將收集的菌絲體置于80℃干燥箱恒溫烘干后稱重。試驗以原始菌株(未誘變菌株) 作為對照，每個處理和對照均重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，并采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析。采用多因素方差分析統(tǒng)計各處理平均數(shù)差異，以及Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行處理間差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波誘變對木霉T-YS菌株菌落直徑的影響

微波誘變對木霉T-YS菌株生長具有不同程度的影響。不同微波誘變時間處理后，木霉T-YS菌株生長隨著處理后培養(yǎng)時間的增加而增加。與對照相比，培養(yǎng)第2 d，經(jīng)微波誘變處理45，60和75 s后其菌落直徑明顯高于對照，較對照分別提高15.4%，30.8%和23.1%。培養(yǎng)第3 d，經(jīng)微波誘變處理30，45和60 s和75 s后木霉T-YS菌株菌落直徑較對照分別提高2.1%、6.3%、16.7%和10.4%，但在處理后培養(yǎng)第4 d，不同處理下木霉T-YS菌株生長無顯著差異。因此，微波處理的最佳誘變時間為60 s (表1)。

表1 不同微波誘變時間處理下木霉T-YS菌株的生長

注：數(shù)據(jù)均為3個重復(fù)的平均值；不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗在P<0.05水平差異顯著

2.2 微波誘變對木霉T-YS菌株產(chǎn)孢量的影響

微波誘變對木霉T-YS菌株產(chǎn)孢量具有一定程度的影響。與對照相比，當(dāng)誘變時間為15～60 s時，誘變菌株產(chǎn)孢量隨著誘變時間的增加逐漸增加，尤其當(dāng)誘變時間為60 s時，其產(chǎn)孢量達(dá)到最大值，為2.28×107cfu/mL，且與對照相比差異顯著(P<0.05)，但誘變時間增加至75 s時，產(chǎn)孢量顯著降低，即微波處理的最佳產(chǎn)孢誘變時間為60 s (表2)。

2.3 微波誘變對木霉T-YS菌株菌絲干重的影響

與對照相比，當(dāng)微波誘變時間為45～75 s時，誘變木霉T-YS菌株的菌絲干重高于對照菌株，尤其當(dāng)微波誘變處理60 s時，其菌絲干重達(dá)到最大值，較對照提高34.6%。此外，經(jīng)微波誘變處理45 s和75 s后誘變菌株菌絲干重較對照分別提高1.9%和15.4%。然而，經(jīng)微波誘變處理15 s和30 s后誘變菌株菌絲干重低于對照，但是與對照菌絲干重相比差異不顯著(圖1)。

表2 不同微波誘變時間處理下木霉T-YS菌株的產(chǎn)孢量

注：數(shù)據(jù)均為處理后第5 d的產(chǎn)孢量，同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

圖1 不同微波誘變時間處理下木霉T-YS菌株菌絲的干重Fig.1 Effects of different microwave mutagenesis time on mycelial dry weight ofTrichodermaT-YS strain注：不同小寫字母表示P<0.05上各處理間的差異性

2.4 紫外誘變對木霉T-YS菌株菌落直徑的影響

紫外誘變對木霉T-YS菌株的生長具有不同程度的影響，并且當(dāng)誘變處理培養(yǎng)第2和3 d時，不同誘變時間對木霉T-YS菌株的生長存在明顯的影響。與對照相比，經(jīng)紫外誘變處理0.5、1、3和5 min后，誘變木霉T-YS菌株培養(yǎng)第2 和3 d時的菌落直徑明顯高于對照，尤其紫外誘變處理時間為1 min，木霉T-YS菌株的菌落直徑達(dá)到最高。然而，當(dāng)誘變處理后培養(yǎng)4 d時，其不同處理對木霉T-YS菌株的生長影響無差異性。因此，紫外誘變處理的最佳誘變時間為1 min (表3)。

表3 不同紫外誘變時間處理下木霉T-YS菌株的生長

2.5 紫外誘變對木霉T-YS菌株產(chǎn)孢量的影響

結(jié)果表明，紫外誘變處理對木霉T-YS菌株產(chǎn)孢量具有不同程度的影響，當(dāng)誘變時間為0.5～1 min時，其產(chǎn)孢量隨著誘變時間的增加逐漸增加，尤其是當(dāng)誘變時間達(dá)1 min時其產(chǎn)孢量達(dá)到最大值，產(chǎn)孢量為2.31×107cfu/mL。然而，當(dāng)紫外誘變時間為7 min時，與對照相比其產(chǎn)孢量顯著降低，且顯著低于對照(表4)。

表4 不同紫外誘變時間處理下木霉T-YS菌株的產(chǎn)孢量

注：數(shù)據(jù)為處理后第5 d的產(chǎn)孢量，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.6 紫外誘變對木霉T-YS菌株菌絲干重的影響

紫外誘變處理對木霉T-YS菌株菌絲干重具有不同的程度的促進(jìn)作用，當(dāng)誘變時間為1 min時，其菌絲干重達(dá)到最大值，菌絲平均干重為0.042 g。紫外誘變處理0.5 min和5 min后，其菌絲干重與對照組相比差異顯著，菌絲平均干重分別為0.038 g和0.027 g。然而，當(dāng)誘變時間為3 min和7 min時菌絲干重與對照相比差異不顯著 (圖2)。

圖2 不同紫外誘變時間處理下木霉T-YS菌株菌絲的干重Fig.2 Effect of different ultraviolet mutagenesis time on mycelial dry weight ofTrichodermaT-YS strain注：數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，小寫字母表示在0.05水平上各處理間的差異性

3 討論

目前，有關(guān)提高和改良有益微生物菌株功能的手段主要有誘變育種、紫外誘變、原生質(zhì)體融合和遺傳改造等[12-15]，其中誘變育種技術(shù)是一種設(shè)備簡單、操作簡便、安全可靠和應(yīng)用廣泛的微生物菌株改良方法[16-17]。同時，研究表明利用紫外和微波誘變育種手段可顯著提高鏈霉菌產(chǎn)生抗生素的能力[18]。陳力力等[19]通過微波誘變獲得高產(chǎn)井岡霉素的菌株4株，其平均效價顯著高于突變株17.5%、15.0%、20.0%和21.7%，且其遺傳性能穩(wěn)定；蘭時樂等[20]通過微波誘變結(jié)合化學(xué)誘變的方式，選育獲得1株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌株；史君等[21]通過紫外誘變獲得1株高產(chǎn)抗菌物質(zhì)的枯草芽孢桿菌，其誘變條件為15 W和1 min，與試驗紫外誘變條件一致。秦濤等[22]通過微波誘變獲得經(jīng)多次傳代后遺傳性狀穩(wěn)定、濾紙酶活力和羧甲基纖維素酶活力較高的綠色木霉A10突變菌株WB6。周樂聰[23]發(fā)現(xiàn)木霉紫外突變株幾丁質(zhì)酶活性和β-1,3葡聚糖酶活性明顯高于野生型菌株，且對病原菌的拮抗作用顯著增強(qiáng)，但關(guān)于如何改良和提高木霉菌生長方面的研究較少。李劍峰等[17]研究發(fā)現(xiàn)高效解磷和高產(chǎn)生長素的苜蓿根瘤菌最佳微波誘變功率和誘變時間為600 W (30 s) 和800 W (6 s)。試驗結(jié)果與前期研究結(jié)果相似，但是在誘變時間上略有不同。另外，前期研究表明，微生物菌株經(jīng)過誘變后，除了對其生長量和生長速率造成影響外，還對其功能產(chǎn)生一定的影響[24]，但是有關(guān)微波和紫外誘變對木霉T-YS菌株生防功能的影響在今后還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

試驗研究表明2種誘變方式對木霉T-YS菌株生長具有明顯的影響，且篩選獲得微波誘變最佳時間為60 s (700 W)，紫外誘變最佳時間為1 min (10 W)。研究結(jié)果在木霉菌的選育和生防木霉制劑的開發(fā)方面具有一定的應(yīng)用前景，但是有關(guān)微波和紫外誘變對木霉T-YS菌株生長影響的機(jī)理，以及誘變對其生防功能影響等方面還有待進(jìn)一步研究。