吉仕夏，劉乙祥，姜紅鷹，李從剛，姜 凌*，劉買利*

(1.中國科學(xué)院生物磁共振重點實驗室，波譜與原子分子物理國家重點實驗室，武漢磁共振中心(中國科學(xué)院 武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)，湖北 武漢 430071；2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

圖1 組氨酸側(cè)鏈基團在蛋白酶催化反應(yīng)過程中的作用Fig.1 The role of the histidine side chain group in the process of protease catalysisA.balance of different protonation states of histidine side chains；B.crystal structure of complex at pH 8.0(dark,PDB:3DGE) and pH 5.0(light,PDB:5HUT),respectively,where in the CA domain of HK853 is in purple,the DHp domain of HK853 in cyan,and RR468 in green[13-14](A.組氨酸側(cè)鏈不同質(zhì)子化態(tài)的平衡；RR468復(fù)合物分別在pH 8.0(深色，PDB：3DGE)和pH 5.0時的晶體結(jié)構(gòu)(淺色，PDB：5HUT)，其中紫色為HK853的CA結(jié)構(gòu)域，青色為HK853的DHp結(jié)構(gòu)域，綠色為RR468[13-14])

雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)( Two-component signal transduction system，TCS)是細菌感知和響應(yīng)周圍環(huán)境的主要手段[1]，細菌的絕大多數(shù)生理過程(例如感知滲透壓[2]、營養(yǎng)元素的代謝[3]、細胞壁的合成、細胞的增殖和分裂[4]等)都受到雙組分系統(tǒng)的調(diào)控。雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在細菌中廣泛存在，平均每個物種有超過20個雙組分系統(tǒng)，一些真菌和植物中也發(fā)現(xiàn)了雙組分系統(tǒng)，但是目前為止尚未在人類和其他哺乳動物中發(fā)現(xiàn)它的存在[5-6]。雙組分系統(tǒng)也被認為是一種潛在的抗菌藥物靶點，正確認識其生物作用/功能的分子機制，有利于為日趨嚴重的細菌耐藥性問題提供新的抗菌藥物靶點[7]，為對抗相關(guān)疾病提供新的潛在的方向。

雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)主要由兩類蛋白組成：組氨酸激酶(Histidine kinase，HK)和應(yīng)激調(diào)節(jié)蛋白(Response regulator，RR)[8]。HK蛋白由膜外的Sensor結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、胞內(nèi)的DHp結(jié)構(gòu)域(Dimerization and histidine phosphotransfer domain)和 CA結(jié)構(gòu)域(Catalytic and ATP binding domain)組成[6,9]。其中最為重要的結(jié)構(gòu)域DHp是形成二聚體界面的核心區(qū)域，并且含有高度保守的組氨酸殘基以實現(xiàn)磷酸轉(zhuǎn)移。大多數(shù)HK蛋白具有多功能性，不僅能實現(xiàn)自身磷酸化并傳遞磷酸基團給RR蛋白，還能介導(dǎo)催化RR蛋白的去磷酸化[10-12]。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，HK853的磷酸酶功能受pH值調(diào)控，在不同pH值條件下，HK853胞內(nèi)全長蛋白(HK853cp)與底物RR468的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)不同，特別是參與去磷酸化反應(yīng)的His260殘基的咪唑側(cè)鏈空間位置發(fā)生變化(圖1B)[13-14]。組氨酸的咪唑側(cè)鏈在催化反應(yīng)中常通過不同的質(zhì)子化狀態(tài)靈活調(diào)控反應(yīng)進程(圖1A)，但是受限于晶體結(jié)構(gòu)的分辨率，關(guān)鍵殘基His260在催化去磷酸化反應(yīng)時的質(zhì)子化狀態(tài)并不清晰。由于蛋白復(fù)合物的分子量超過80 kDa，普通的同位素標記方法無法獲得可分辨的NMR信號，本研究對DHp結(jié)構(gòu)域的組氨酸殘基側(cè)鏈采用選擇性標記的方法，獲得了清晰的NMR信號，有利于運用核磁共振方法研究His260側(cè)鏈的質(zhì)子化狀態(tài)，闡明HK853行使磷酸酶功能時的酸堿調(diào)控機制。

1 實驗部分

1.1 表達與純化

1.1.1 HK853cp、HK853DHp及RR468的表達13Cε1-His選擇性標記的蛋白的表達，需將HK853cp或其突變體(H260A、H301A、H347A、H419A、H456A)、HK853DHp或其突變體(H259A、H260A、H301A)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至組氨酸缺陷型大腸桿菌菌株BL21(DE3)-His-中[15]，于LB固體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)后，接種至5 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移至添加了非標記的組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的M9培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600達到0.8～1.0，然后轉(zhuǎn)移至新的添加了13Cε1標記的組氨酸和非標記的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的M9培養(yǎng)基中，加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG),于20 ℃誘導(dǎo)表達10 h，6 000 r/min離心10 min收菌，菌體保存于-20 ℃冰箱。

非標記的RR468的表達，需將RR468的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，并于LB固體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，然后接種至LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,于20 ℃誘導(dǎo)表達16～20 h，6 000 r/min離心10 min收菌，菌體保存于-20 ℃冰箱。

1.1.2 HK853cp、HK853DHp及RR468的純化HK853cp的純化：將菌液超聲破碎，20 000 r/min離心30 min，取上清液加入40%的硫酸銨使蛋白沉淀，20 000 r/min離心30 min，沉淀重懸后于65～70 ℃加熱30 min，除去部分雜蛋白，20 000 r/min高速離心后留取上清。樣品液用0.22 μm濾膜過濾后，上樣至QFF離子交換柱(緩沖液為Buffer A和Buffer B，見表1)，以15%～50%體積分數(shù)的Buffer B進行梯度洗脫，收集目標蛋白并濃縮樣品液體積至5 mL以內(nèi)；再用S-200分子篩柱(緩沖液為Buffer C)對蛋白進一步純化，收集目標蛋白并濃縮樣品液體積至5 mL以內(nèi)；最后用脫鹽柱去除鹽離子(緩沖液為ddH2O)。分裝蛋白并凍干，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 蛋白質(zhì)純化的緩沖液配方Table 1 Buffer for mulation for protein purification

HK853DHp的純化：將菌液超聲破碎后，20 000 r/min離心30 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾，上樣至MBP標簽親和柱(緩沖液為Buffer D和Buffer E)，Buffer D沖洗至紫外吸光光度值達到基線值后，用Buffer E洗脫，收集目標蛋白并濃縮樣品液體積至5 mL以內(nèi)；用Buffer F作緩沖液經(jīng)脫鹽柱脫鹽后，再用Buffer F透析24 h，除去NaCl和麥芽糖(NaCl和麥芽糖會影響TEV酶切效率)；加入TEV酶25 ℃下酶切過夜，切除MBP標簽；用Buffer D透析4 h后，過MBP柱層析(緩沖液為Buffer D和Buffer E)分離除去MBP標簽蛋白；然后進行鎳柱層析(緩沖液為Buffer G和Buffer H)，梯度洗脫(目標蛋白在12%Buffer H時洗脫)分離除去TEV酶；最后進行脫鹽，再凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

RR468的純化：將菌液超聲破碎后于60 ℃加熱30 min，除去雜蛋白，20 000 r/min高速離心后留取上清。樣品液用0.22 μm濾膜過濾，上樣至QFF離子交換柱(緩沖液為Buffer A和Buffer B)。用0%～30%體積分數(shù)的Buffer B進行梯度洗脫，收集目標蛋白并濃縮樣品液體積至5 mL以內(nèi)；再用S-100分子篩柱(緩沖液為Buffer C)對蛋白進一步純化，收集目標蛋白并濃縮樣品液體積至5 mL以內(nèi)；最后用脫鹽柱去除鹽離子(緩沖液為ddH2O)。分裝蛋白并凍干以備用。

1.2 去磷酸化功能實驗

1.2.1 RR468磷酸化樣品的制備將6 mg/mL的RR468蛋白與12.5 mmol/L的乙酰磷酸在含20 mmol/L Tris(或NaAc)、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2的緩沖液中混合，于25 ℃下反應(yīng)1 h；然后在同樣的緩沖液體系下進行脫鹽柱層析，除去多余的乙酰磷酸，得到磷酸化的RR468蛋白；最后分裝蛋白，并于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩７謩e在不同pH值的緩沖液中反應(yīng)，可制得不同pH值環(huán)境下的磷酸化RR468樣品。

1.2.2 不同pH值下HK853的去磷酸化速率比較將P～RR468(磷酸化的RR468)與HK853DHp蛋白按照物質(zhì)的量之比10∶1的比例混合，在4 ℃下反應(yīng)，間隔不同時間取樣，時間間隔分別為0、5、10、20、40、60、90 min，另外設(shè)置不加入HK853DHp的P～RR468為對照組并同時取樣，用液氮速凍終止反應(yīng)，然后利用Phos-Tag凝膠電泳實驗表征反應(yīng)結(jié)果。

1.3 核磁共振實驗

1.3.11H-13C HSQC實驗1H-13C HSQC實驗于Bruker Avance 700 MHz核磁共振譜儀上完成。將凍干的HK853cp或HK853DHp蛋白樣品溶于含有20 mmol/L HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)、50 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2和10%D2O的緩沖溶液中，復(fù)合物樣品則額外加入5 mmol/L BeCl2、50 mmol/L NaF和略過量的RR468，蛋白終濃度為0.5～1.0 mmol/L，pH值調(diào)為7.0，實驗溫度為298 K。實驗參數(shù)：F2(1H)和F1(13C)維譜寬分別設(shè)為7 002.801 Hz和1 760.892 Hz，采樣數(shù)據(jù)點陣t2×t1=2 048×256，累加次數(shù)ns=16，弛豫等待時間d1=1.0 s。在pH滴定實驗中，通過改變樣品的pH值，采集相應(yīng)pH值下的1H-13C HSQC譜。

1.3.21H-13C HSQC譜圖的信號歸屬由于13Cε1-His選擇性標記樣品的譜圖簡單，信號少，本研究通過定點突變的方式對1H-13C HSQC譜圖的信號進行歸屬。

信號歸屬實驗于Bruker Avance 700 MHz核磁共振譜儀上完成，實驗數(shù)據(jù)使用軟件Bruker Topspin 3.2處理。將HK853cp的各個組氨酸位點分別突變?yōu)楸彼?，得到突變體H260A-HK853cp、H301A-HK853cp、H347A-HK853cp、H419A-HK853cp和H456A-HK853cp，將HK853DHp的各個組氨酸位點分別突變?yōu)楸彼?，得到突變體H249A-HK853cp、H260A-HK853cp和H301A-HK853cp。再采集各個突變體13Cε1-His選擇性標記樣品的1H-13C HSQC譜圖。結(jié)合野生型和突變體蛋白的1H-13C HSQC譜圖，對13Cε1-His選擇性標記樣品的1H-13C HSQC譜圖進行信號歸屬。

2 結(jié)果與討論

2.1 選擇性同位素標記與信號歸屬

本研究對咪唑基團的Cε1位置進行選擇性標記，并使用組氨酸缺陷型大腸桿菌菌株BL21(DE3)-His-以保障標記的順利進行，減少交叉串?dāng)_。選擇這一標記位點，是因為咪唑基團的質(zhì)子化發(fā)生在Nε1和Nε2位點，Cε1與它們距離相近，對化學(xué)位移變化敏感，而且碳氫鍵十分穩(wěn)定，不會受到溶液質(zhì)子交換的影響，是理想的表征咪唑基團質(zhì)子化程度的原子探針。通過氨基酸定點突變對HK853cp的1H-13C HSQC譜進行了信號歸屬和驗證。HK853cp共含有5個組氨酸殘基，譜圖(圖2A)下部的信號分別對應(yīng)于HK853 DHp結(jié)構(gòu)域的His301和His260位點，以及位于CA結(jié)構(gòu)域Loop區(qū)的His419；譜圖上部的信號分別對應(yīng)CA結(jié)構(gòu)域α-螺旋上的His456和His347(圖2A)。其中His301、His260和His419在后續(xù)的pH滴定中均表現(xiàn)出化學(xué)位移變化，而His456和His347處于蛋白質(zhì)的疏水內(nèi)部，無法與溶液發(fā)生質(zhì)子交換，因此在pH滴定中未表現(xiàn)出化學(xué)位移的變化。HK853的DHp結(jié)構(gòu)域共含有2個組氨酸殘基，分別為His301和His260(圖2B)。需要指出的是，圖2B中的His249是設(shè)計蛋白質(zhì)純化標簽時額外引入的，TEV酶切后殘留了一個組氨酸殘基，不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。

2.2 pH滴定譜圖

2.3 形成復(fù)合物對HK853 His260側(cè)鏈pKa值的影響

酸度系數(shù)pKa是一種描述酸解離質(zhì)子能力的物理量，其值越小說明解離出質(zhì)子的能力越強。從圖3A中可以看到，His249和His301兩個組氨酸位點在形成復(fù)合物前后pKa值變化較小，說明復(fù)合物的形成對于兩個位點幾乎沒有影響。His260位點的pKa值在形成復(fù)合物之后明顯減小，響應(yīng)明顯異于其它位點。這是由于His260位點是HK853磷酸酶催化活性的關(guān)鍵位點，pKa對復(fù)合物的形成十分敏感，形成復(fù)合物前His260的pKa值為6.5左右，與其他組氨酸位點近似，而形成復(fù)合物后pKa值減小，意味著該咪唑側(cè)鏈的質(zhì)子更易于離去，pH值小于6.0時即大部分處于去質(zhì)子化狀態(tài)。

從圖3B可以看到，無論是HK853的胞內(nèi)全長(HK853cp)還是DHp結(jié)構(gòu)域(HK853DHp)，在形成類磷酸化復(fù)合物之后His260位點的pKa值都明顯減小，變化趨勢和變化幅度基本一致，說明具有磷酸酶活性的主要結(jié)構(gòu)域為DHp。形成復(fù)合物之后His260咪唑側(cè)鏈在中性條件下即處于去質(zhì)子化狀態(tài)，有利于催化底物的去磷酸化反應(yīng)。

2.4 pH值對HK853磷酸酶活性的影響

根據(jù)上述測定的pKa值，通過HK853DHp的去磷酸化功能實驗?zāi)軌蚝芎玫卣f明pH值對HK853磷酸酶活性的影響。實驗設(shè)計了4種pH值溶液條件(pH 5.0,6.0,7.0,8.0)，將HK853DHp與底物P～RR468混合，在不同反應(yīng)時間點取樣，測定HK853DHp的去磷酸化能力。凝膠電泳出現(xiàn)上下兩個條帶，分別為P～RR468和RR468(圖4)。由于P～RR468有自去磷酸化的功能，所以每張膠圖的右半部分都用未加HK853的樣品做對照(apo-RR468)。當(dāng)反應(yīng)溶液pH 值(5.0)小于His260的pKa時(圖4A)，HK853DHp不能明顯加速底物P～RR468的去磷酸化；當(dāng)pH 值(6.0)接近His260的pKa時，HK853DHp的催化能力加強，RR468條帶漸深(圖4B)；當(dāng)反應(yīng)溶液pH值大于His260的pKa時(圖4C，4D)，底物P～RR468的濃度顯著減少，apo-RR468的濃度顯著增加，說明HK853DHp的催化能力大幅增強，而且，在pH 8.0時HK853DHp的去磷酸化速率比在pH 7.0時更快。

3 結(jié) 論

本文運用13Cε1選擇性標記組氨酸側(cè)鏈的咪唑基團的方法研究了HK853與底物形成復(fù)合物前后組氨酸殘基側(cè)鏈的pKa值，發(fā)現(xiàn)His260側(cè)鏈在催化反應(yīng)中呈現(xiàn)去質(zhì)子化狀態(tài)。蛋白質(zhì)的酶活功能實驗說明，不同的pH值下組氨酸激酶HK853的磷酸酶活性表現(xiàn)出顯著差異，這可能是細菌通過雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)應(yīng)對外界pH值變化的一個重要手段。在一般的組氨酸殘基參與的蛋白酶催化過程中，組氨酸的pKa值大致為6.6～6.8[17]，而在本實驗結(jié)果中，形成復(fù)合物之前自由態(tài)的HK853cp和HK853DHp的pKa值比較接近這個范圍，而形成復(fù)合物之后pKa值則下降到5.8～6.0。實驗結(jié)果說明，當(dāng)酶與底物形成復(fù)合物后，催化位點pKa值降低，即使在pH 6.0條件下His260咪唑基團也是以去質(zhì)子態(tài)的形式存在，有助于磷酸酶活性的提高，有利于保證酸堿調(diào)控的效率。

上述結(jié)果進一步闡明了HK853組氨酸激酶的酸堿調(diào)控機制，為雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控機制的研究提供了新的數(shù)據(jù)。相對于常規(guī)標記方法無法有效解決的大分子量蛋白質(zhì)體系，選擇性標記是更好的選擇，為大分子量蛋白之間相互作用的研究提供了新的思路。

圖5 組氨酸激酶HK853的酸堿調(diào)控機制Fig.5 pH regulatory mechanism of HK853 investigated