余 謙，王 勇，錢(qián)小紅，秦偉捷，張普民，張養(yǎng)軍*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 研究生院，安徽 合肥 230032；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué)) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室，重慶 400038)

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)在人血液中含量約為40 mg/L，約占血漿總蛋白含量的60%[1]，在維持體液的正常分布、保持血容量及血壓等方面起著重要作用[2]。在臨床上用于治療出血性休克、燒傷、肝硬化或者腎病引起的腹水等疾病[3]。另外，HSA還應(yīng)用于藥劑輔料、診斷試劑、手性物質(zhì)分離劑、培養(yǎng)基添加劑等研究[4]。目前，僅從人血液中提取HSA難以滿足市場(chǎng)的需求，且人血來(lái)源極其復(fù)雜，存在血源污染等潛在威脅[5]。因此，迫切需要一種安全可靠、成本相對(duì)低廉的HSA替代品。

隨著基因重組技術(shù)飛速發(fā)展，通過(guò)基因工程獲得重組人血清白蛋白(Recombinant human serum albumin,rHSA)已成為可能。由于該技術(shù)能夠克服傳統(tǒng)方法存在的血源供應(yīng)不足以及血源污染等缺陷，已經(jīng)成為研究和生產(chǎn)rHSA的重點(diǎn)技術(shù)。如Lawn等[6]在大腸桿菌(E.coli)中成功表達(dá)了rHSA；日本三菱公司Sumi等[7]利用畢赤酵母作為表達(dá)系統(tǒng)，獲得的rHSA產(chǎn)量高達(dá)10 g/L；華北制藥有限公司鄧建慧等[8]設(shè)計(jì)的“發(fā)酵生產(chǎn)重組人血清白蛋白HSA的方法”獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利；He等[9]利用水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)植物源rHSA，每1 kg種子提取的rHSA量可達(dá)2.75 g；Peng等[10]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)豬受精卵的基因組進(jìn)行編輯，在豬白蛋白基因區(qū)域插入人血清白蛋白基因，使豬血中只產(chǎn)生rHSA，通過(guò)純化豬血漿獲得大量高純度的rHSA。由于轉(zhuǎn)基因豬血中分離純化的rHSA必須符合臨床用藥和生化研究的要求，因此，分離純化rHSA是從轉(zhuǎn)基因豬血中制備rHSA的關(guān)鍵步驟。為此，本工作采用低溫乙醇沉淀法的改良方法[11]，即熱乙醇沉淀法[12-13]與多級(jí)色譜法[14]相結(jié)合的分離純化方法，從豬血中獲得了高純度和高收率的rHSA，從而為規(guī)?；膔HSA制備奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Rigol L-3000高效液相色譜(北京普源精儀科技有限責(zé)任公司)；IEC CM-825色譜柱(75 mm×8 mm，8 μm，日本Shodex公司)；BioSuite DEAE AXC色譜柱(75 mm×7.5 mm，10 μm，美國(guó)Waters公司)；BEH C4色譜柱(250 mm×4.6 mm，3.5 μm，美國(guó)Waters公司)；RCT basic加熱磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司)；7020全自動(dòng)生化分析儀(日本HITACHI公司)；pH測(cè)量?jī)x、EASY-nLC 1 000納升級(jí)液相色譜儀、Q ExactiveTMHF質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

人血白蛋白注射液(Baxter HSA，美國(guó)Baxter公司)；植物源重組人血清白蛋白注射液(Heyuan rHSA，武漢禾元生物科技有限公司)；預(yù)染蛋白Marker(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；測(cè)序級(jí)修飾胰蛋白酶(美國(guó)Promega公司)；白蛋白(ALB)測(cè)定試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)；辛酸鈉(北京萬(wàn)佳首化生物科技有限公司)；無(wú)水乙醇(北京化工廠)；氯化鈉(西隴化工股份有限公司)；濃鹽酸、氫氧化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；Tris(美國(guó)Affymetrix公司)；三氟乙酸、乙腈(美國(guó)Sigma公司)；所用試劑均為分析純。

1.2 rHSA分離純化方法

1.2.1 初步分離血漿將80 g/L的檸檬酸鈉溶液與新鮮轉(zhuǎn)基因豬血按體積比1∶19混勻，2 000×g離心30 min，取上清，即轉(zhuǎn)基因豬血漿，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熱乙醇沉淀法將凍存的血漿在4 ℃解凍，2 000×g離心15 min，取上清；加入等體積含有6 g/L辛酸鈉、8 g/L氯化鈉和14%(體積分?jǐn)?shù))無(wú)水乙醇的混合水溶液，調(diào)節(jié)pH至5.0～7.0，在不斷機(jī)械攪拌條件下，加熱溶液至55～70 ℃，恒溫保持20～60 min；移至冰水浴，不斷攪拌，待溶液冷卻至室溫后，調(diào)節(jié)pH值至4.3；室溫靜置2 h后在5 000×g條件下離心30 min，收集上清液和沉淀，沉淀用pH 4.8的蒸餾水淋洗，在相同條件下再次離心，取上清液，2次上清液混合即為粗提取的rHSA上清液。

1.2.3 多級(jí)色譜分離法對(duì)熱乙醇沉淀法粗提的rHSA上清液進(jìn)行離子交換色譜分離，收集目標(biāo)組分；再將目標(biāo)組分經(jīng)過(guò)反相色譜進(jìn)一步純化，收集最終目標(biāo)組分，冷凍干燥后進(jìn)行純度分析。

(1)陽(yáng)離子交換色譜：采用陽(yáng)離子交換色譜柱Shodex IEC CM-825；流動(dòng)相A為0.02 mol/L 醋酸鈉(pH 4.6)，流動(dòng)相B為0.02 mol/L 醋酸鈉-0.3 mol/L NaCl(pH 5.2)；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫25 ℃；梯度洗脫程序：0～10 min，100% A；10～15 min，100%～50% A；15～25 min，50% A；25～50 min，50%～0% A；50～70 min，0% A。

(2)弱陰離子交換色譜：采用弱陰離子交換色譜柱BioSuite DEAE AXC；流動(dòng)相A為0.02 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)，流動(dòng)相B為0.02 mol/L Tris-HCl+0.3 mol/L NaCl(pH 8.8)；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫25 ℃(室溫)；梯度洗脫程序：0～5 min，100% A；5～50 min，100%～0% A；50～60 min，0% A。

(3)反相色譜：采用反相色譜柱BEH C4；流動(dòng)相A為2%(體積分?jǐn)?shù))乙腈-0.1% 三氟乙酸溶液，流動(dòng)相B為98% 乙腈-0.1% 三氟乙酸溶液；流速0.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫35 ℃；梯度洗脫程序：0～10 min，100% A；10～45 min，100%～5% A；45～50 min，5% A；50～53 min，5%～100% A；53～60 min，100% A。

1.3 rHSA純度的表征方法

1.3.1 反相色譜法表征采用反相色譜柱BEH C4對(duì)收集的目標(biāo)組分進(jìn)行純度表征，所用反相色譜條件同上。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)表征采用10% SDS-PAGE凝膠對(duì)收集的目標(biāo)組分進(jìn)行純度表征。凝膠制備方法：分離膠為10% 丙烯酰胺、0.1% 十二烷基硫酸鈉、0.1% 過(guò)硫酸銨、0.01% 四甲基乙二胺及40% 1.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)的混合水溶液；濃縮膠為5% 丙烯酰胺、0.1% 十二烷基硫酸鈉、0.1% 過(guò)硫酸銨、0.01% 四甲基乙二胺及10% 1 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)的混合水溶液。

1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜表征條件：酶解肽段混合物使用流動(dòng)相A(0.1% FA溶液)溶解，上樣體積5 μL，流速600 nL/min。使用二元泵進(jìn)行高壓混合梯度洗脫(流動(dòng)相B為0.1% FA乙腈溶液)，洗脫梯度為：0～30 min，95%～70% A；30～40 min，70%～5% A；40～46 min，5% A；46～47 min，5%～95% A；47～52 min，95% A。選擇正離子模式，噴霧電壓為2.4 kV，一級(jí)掃描范圍為m/z350～1 600，分辨率為120 000，動(dòng)態(tài)增益控制(AGC target)為3×106；二級(jí)掃描分辨率為30 000，動(dòng)態(tài)增益控制(AGC target)為5×104，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間(Dynamic exclusion)為12.0 s。

數(shù)據(jù)庫(kù)檢索：質(zhì)譜分析RAW文件使用MaxQuant軟件(1.5.3.8 版本)進(jìn)行分析。Maxquant搜索參數(shù)設(shè)置：一級(jí)質(zhì)譜掃描母離子肽段質(zhì)量誤差為20 ppm，二級(jí)質(zhì)譜掃描肽段碎片離子質(zhì)量誤差為20 mmu，蛋白質(zhì)酶解選擇胰蛋白酶，最大漏切位點(diǎn)設(shè)為2個(gè)；固定修飾為半胱氨酸烷基化修飾，可變修飾為甲硫氨酸氧化修飾，肽段假陽(yáng)性率為1%；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)分別為豬、水稻和人全蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(2018年8月15日下載于Uniprot 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù))。

1.4 rHSA的回收率

圖1 rHSA分離純化技術(shù)路線Fig.1 Strategy of rHSA separation and purification

rHSA濃度采用白蛋白(ALB)測(cè)定試劑盒測(cè)定，即在pH 4.2條件下，樣本中的白蛋白與溴甲酚綠偶合形成藍(lán)綠色絡(luò)合物，在630 nm處有吸收峰，顏色深淺與樣本中的白蛋白濃度成正比。與同樣處理的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液做比較，可求得樣本中白蛋白含量。試劑盒中包含R液和S液，將R液放入日立7020型全自動(dòng)生化分析儀中相應(yīng)的試劑盤(pán)位置，再用試劑盒中的S液(校準(zhǔn)液)放入進(jìn)樣盤(pán)中進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)完畢后測(cè)試樣本中rHSA濃度，并計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 rHSA分離純化流程

取新鮮的轉(zhuǎn)基因豬血，加入抗凝劑，離心去除血細(xì)胞后，經(jīng)熱乙醇沉淀法粗提取rHSA，再經(jīng)過(guò)多級(jí)色譜分離法(陰離子交換色譜法和反相色譜法)精純化，最終獲得高純度的rHSA，具體分離純化技術(shù)路線如圖1所示。

表1 pH值對(duì)rHSA純度和回收率的影響Table 1 Effect of pH value on purity and recovery of rHSA

表2 加熱溫度對(duì)rHSA純度和回收率的影響Table 2 Effect of heating temperature on purity and recovery of rHSA

2.2 熱乙醇沉淀法

2.2.1 pH值的影響在加熱溫度65 ℃和恒溫反應(yīng)時(shí)間60 min的條件下，考察了反應(yīng)體系不同pH值(5.0～7.0)對(duì)熱乙醇沉淀法提取rHSA純度和回收率的影響。含rHSA上清液外觀、反相色譜表征純度及回收率列于表1。由表1可看出，當(dāng)pH 6.5時(shí)，rHSA的純度(75.7%)和回收率(44.5%)均較為理想，故選擇pH 6.5作為熱乙醇沉淀法提取rHSA的最佳pH值。

2.2.2 加熱溫度的影響在反應(yīng)體系pH 6.5和恒溫反應(yīng)時(shí)間60 min的條件下，考察了不同加熱溫度(50～70 ℃)對(duì)熱乙醇沉淀法提取rHSA純度和回收率的影響。含rHSA上清液外觀、反相色譜表征純度及回收率列于表2。結(jié)果顯示，當(dāng)加熱溫度為65 ℃時(shí)，rHSA的純度和回收率均較為理想，故將65 ℃作為熱乙醇沉淀法提取rHSA的最佳加熱溫度。

2.2.3 恒溫反應(yīng)時(shí)間的影響在反應(yīng)體系pH 6.5和加熱溫度65 ℃的條件下，考察了不同恒溫反應(yīng)時(shí)間(20～60 min)對(duì)熱乙醇沉淀法提取rHSA純度和回收率的影響，并考察含rHSA上清液外觀、反相色譜表征純度及回收率數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，在考察的恒溫反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，含rHSA的上清液均為澄清。且當(dāng)恒溫反應(yīng)時(shí)間40 min時(shí)，rHSA的純度(69.5%)和回收率(51.3%)均為最佳，故選擇40 min作為熱乙醇沉淀法提取rHSA的最佳恒溫反應(yīng)時(shí)間。

2.2.4 稀釋倍數(shù)的影響為了考察不同稀釋倍數(shù)(稀釋倍數(shù)=原液濃度/(原液濃度×移取體積/定容體積))對(duì)熱乙醇沉淀法提取rHSA純度和回收率的影響，將豬血漿按不同倍數(shù)(2、4、6、10倍)稀釋?zhuān)⒄{(diào)節(jié)pH值為6.5，加熱溫度為65 ℃，恒溫反應(yīng)40 min，離心后得到含rHSA上清液。觀察含rHSA上清液的外觀，并測(cè)定反相色譜表征純度及回收率。結(jié)果顯示，隨著稀釋倍數(shù)的增加，反應(yīng)體系過(guò)度稀釋會(huì)使其他血清蛋白不能完全變性沉淀分離，導(dǎo)致純度降低，不能滿足rHSA純化的要求。故在pH 6.5，加熱溫度為65 ℃，恒溫反應(yīng)40 min的條件下，選擇2倍稀釋倍數(shù)作為熱乙醇沉淀法提取rHSA的最佳反應(yīng)條件。

綜上，最終確定將血漿按2倍稀釋?zhuān)趐H 6.5以及65 ℃恒溫加熱下反應(yīng)40 min作為熱乙醇沉淀法的最佳反應(yīng)條件。采用該條件對(duì)血漿熱乙醇沉淀純化后的rHSA上清液進(jìn)行反相色譜和SDS-PAGE表征，同時(shí)與商品化的植物源Heyuan rHSA樣本進(jìn)行同樣表征作為對(duì)照，結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果顯示，在最佳條件下，熱乙醇沉淀法制備的rHSA反相色譜表征純度約為69.5%(圖2A)；商品化的Heyuan rHSA反相色譜表征純度為100.0%(圖2B)；根據(jù)SDS-PAGE電泳表征(蛋白上樣量均為7 μg，圖2C)，將熱乙醇沉淀后rHSA(泳道2～6)與Heyuan rHSA(泳道7)純度進(jìn)行比較，在10、13、25、100 kDa處還存在雜質(zhì)蛋白，需采用多級(jí)色譜分離方法進(jìn)一步純化。而經(jīng)熱乙醇沉淀法純化后，測(cè)得rHSA的回收率約為51.3%。

2.3 陰離子交換色譜法

由于白蛋白的等電點(diǎn)約為4.7～4.9，因此，既可選擇陽(yáng)離子交換色譜也可以選擇陰離子交換色譜對(duì)熱乙醇法純化的白蛋白組分進(jìn)一步純化。為此，首先對(duì)兩種色譜方法的純化結(jié)果進(jìn)行比較。熱乙醇沉淀法粗提取的rHSA分別經(jīng)陽(yáng)離子和陰離子交換色譜純化后，收集它們的產(chǎn)物進(jìn)行反相色譜表征，結(jié)果顯示，陰離子交換色譜的純化產(chǎn)物純度(92.6%)略?xún)?yōu)于陽(yáng)離子交換色譜的產(chǎn)物(90.5%)，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇陰離子交換色譜法對(duì)經(jīng)熱乙醇沉淀法粗提純的rHSA作進(jìn)一步純化。

圖2 熱乙醇沉淀制備的rHSA反相色譜純度表征(A)、商品化植物源Heyuan rHSA反相色譜純度表征(B)及SDS-PAGE純度表征(C)Fig.2 Purity characterization of rHSA after thermal ethanol precipitation(A) and Heyuan rHSA from plants source(B) by a reversed-phase liquid chromatography and their purity characterization by SDS-PAGE(C)

圖3 熱乙醇沉淀后rHSA樣本分別經(jīng)不同流動(dòng)相pH值的陰離子交換純化色譜圖Fig.3 Anion exchange chromatograms of rHSA samples purified by mobile phase with different pH values

2.3.1 流動(dòng)相種類(lèi)與鹽濃度預(yù)試驗(yàn)中選用NaCl作為離子強(qiáng)度試劑，濃度從0 mol/L升至1 mol/L，線性梯度洗脫結(jié)果顯示，樣本中各組分有效洗脫的鹽濃度范圍為0～0.3 mol/L。鹽濃度大于0.3 mol/L后，無(wú)新組分被洗脫，故確定陰離子交換色譜最合適的流動(dòng)相為A相：0.02 mol/L Tris-HCl；B相：0.02 mol/L Tris-HCl+0.3 mol/L NaCl。

2.3.2 流動(dòng)相pH值的影響一般DEAE-弱陰離子交換色譜柱推薦的pH范圍為5.0～9.0。當(dāng)采用鹽濃度從0 mol/L增至0.3 mol/L進(jìn)行線性梯度洗脫時(shí)，考察了流動(dòng)相不同pH值(6.8、7.8、8.8)對(duì)分離純化結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相pH值較高時(shí)能明顯提高樣本中各組分在陰離子交換色譜中的分離效果(見(jiàn)圖3)，因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH 8.8作為陰離子交換色譜流動(dòng)相的最佳pH值。

綜上，采用上述色譜條件對(duì)血漿經(jīng)熱乙醇沉淀純化后的rHSA上清液進(jìn)行陰離子交換色譜分離純化，并收集33.0～43.0 min目標(biāo)組分脫鹽后冷凍干燥，然后將目標(biāo)組分用反相色譜表征純度。結(jié)果顯示，rHSA純度較上一步熱乙醇沉淀法的純度明顯提高，但僅達(dá)到85.0%(面積歸一化法)，還需采用反相色譜進(jìn)一步純化。

2.4 反相色譜法

對(duì)陰離子交換色譜純化后的rHSA產(chǎn)物進(jìn)行反相色譜分離純化，收集28.5～30.0 min組分，脫鹽后冷凍干燥，進(jìn)行反相色譜和SDS-PAGE純度表征，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，經(jīng)反相色譜進(jìn)一步純化后的rHSA純度約為100.0%(圖4A)，與商品化的Heyuan rHSA純度基本一致；采用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)每個(gè)步驟制備rHSA的純度表征結(jié)果可知(圖4B)，rHSA分別經(jīng)熱乙醇沉淀(泳道3)、陰離子交換(泳道4)和反相色譜(泳道5)制備后，與原始豬血漿(泳道2)的條帶進(jìn)行比較，雜質(zhì)條帶逐漸變少；其中反相色譜純化的最終rHSA的電泳條帶與商品化的Heyuan rHSA(泳道6)和Baxter HSA(泳道7)基本一致，未見(jiàn)明顯雜質(zhì)條帶。

另外，采用基于信號(hào)強(qiáng)度的絕對(duì)定量方法(Intensity based absolute quantification,iBAQ)[15]對(duì)產(chǎn)物rHSA的酶切產(chǎn)物(胰蛋白酶酶切)進(jìn)行HPLC-MS/MS和MaxQuant軟件分析，計(jì)算出最終產(chǎn)物rHSA的純度，即將質(zhì)譜鑒定蛋白肽段的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度之和除以該蛋白的理論酶切肽段數(shù)，得到該蛋白的iBAQ值，然后對(duì)鑒定的所有蛋白的iBAQ值進(jìn)行歸一化處理，從而計(jì)算出每個(gè)蛋白在所有鑒定蛋白中的百分比。對(duì)每一純化步驟得到產(chǎn)物用反相色譜表征以及對(duì)陰離子交換色譜和反相色譜純化產(chǎn)物進(jìn)行HPLC-MS/MS表征的結(jié)果列于表3。

表3 各步驟純度表征結(jié)果Table 3 Purity characterization results in different stages (%)

*:no data

結(jié)果顯示，各步驟rHSA經(jīng)反相色譜純度表征后，產(chǎn)品rHSA的純度逐漸升高，最終其純度接近100.0%，與對(duì)照品Heyuan rHSA的100.0%純度基本相同。另外，反相色譜純化的最終產(chǎn)物rHSA經(jīng)HPLC-MS/MS表征的純度約為95.8%，與對(duì)照品Heyuan rHSA的99.8%純度有一定差距，但略高于對(duì)照品Baxter HSA的94.7%，表明采用多步驟純化方法可以較好地分離純化豬血中的rHSA。另外，經(jīng)多級(jí)色譜(陰離子交換色譜和反相色譜)純化后，測(cè)得色譜法純化后rHSA的回收率約為80.1%，故熱乙醇沉淀和多級(jí)色譜純化的總回收率約為41.1%。

3 結(jié) 論

通過(guò)熱乙醇沉淀、陰離子交換色譜和反相色譜多步驟純化方法對(duì)豬血中rHSA純化后，rHSA純度分別從豬血漿中的9.3%提高到熱乙醇沉淀法的69.5%，再到陰離子交換色譜的85.0%，最終達(dá)到反相色譜的100.0%(反相色譜表征)，HPLC-MS/MS表征的純度約為95.8%;總回收率約為41.1%。說(shuō)明本純化方法能夠較好地分離純化豬血中的重組人白蛋白。盡管由于本方法純化的重組人白蛋白仍然存在微量的豬蛋白，目前純度的rHSA尚不能滿足臨床用藥要求，但可用于生化研究，從而為替代人血源rHSA的規(guī)?；苽浞椒ń⒌於嘶A(chǔ)。