羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，張秋炎，朱志鑫，黃 芳，林曉珊，馬葉芬，鄧 欣

(廣東省測試分析研究所 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室 廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070)

我國是世界上植物油產(chǎn)量和消費量最大的國家[1]，廢棄油脂量呈逐年上升，部分不法商販在利益驅(qū)動下，將各種來源的廢棄劣質(zhì)食用油(俗稱“地溝油”)經(jīng)脫色、精煉后作為“正?！笔秤糜弯N售，嚴重威脅人們的身體健康。我國政府高度重視地溝油非法回流到百姓餐桌的問題，國家衛(wèi)生部、質(zhì)監(jiān)部門大大加強了監(jiān)管力度。但由于地溝油的鑒別難度極大，至今仍未發(fā)布標(biāo)準檢測方法，對地溝油也無明確的認定標(biāo)準，導(dǎo)致政府部門難以進行有效監(jiān)管。因此，研究建立指標(biāo)有效、方法可靠的非正常來源食用油的鑒別方法，對于打擊不法分子的上述惡劣行徑、保障廣大人民的食品安全具有重要意義。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究建立了測定油脂的電導(dǎo)率、脂肪酸組成、膽固醇等常規(guī)理化指標(biāo)的鑒別方法[2-7]，但這些方法均存在專一性不強或靈敏度低等不足，很難準確鑒別地溝油。吳惠勤等[8]提出通過檢測食用油中痕量外源性雜質(zhì)成分來鑒別地溝油，研究建立了測定易揮發(fā)外源性雜質(zhì)的氣相色譜-質(zhì)譜法[8-10]以及部分難揮發(fā)外源性雜質(zhì)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]，用于地溝油的鑒別，取得了較滿意的結(jié)果。其他學(xué)者也研究了地溝油中的少數(shù)幾種(2～4種)難揮發(fā)外源性雜質(zhì)[12-15]，但種類覆蓋面小，易漏檢。本文在原有研究基礎(chǔ)上[11]，針對食用油在烹飪過程中與調(diào)味品接觸而引入的雜質(zhì)成分，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)建立了同時測定食用油中來源于4類調(diào)料的9種難揮發(fā)外源性雜質(zhì)成分的方法，這些特征成分包括辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素、胡椒堿、四氫胡椒堿、6-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚和羥基-α-山椒素。本方法樣品處理簡便快速、成本低、靈敏度高、定性可靠、定量準確，為非正常來源食用油的鑒別提供了可靠方法，可為政府相關(guān)部門建立標(biāo)準方法提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290ⅡUHPLC/6470A Triple Quard MS超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；賽多利斯TP-114電子天平(美國Sartorious公司)；XW-80A快速混勻器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；H1850離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；DC12H水浴式氮吹濃縮儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。甲醇、乙腈均為色譜純(德國Merck公司)；甲酸、乙酸、甲酸銨及乙酸銨均為LC-MS級(美國Sigma公司)；實驗用水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

9種對照品及內(nèi)標(biāo)物：辣椒素、二氫辣椒素、胡椒堿、6-姜酚(純度均為98%)購自中國食品藥品檢定研究院；羥基-α-山椒素、10-姜酚、6-姜烯酚和合成辣椒素(純度均為98%)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；四氫胡椒堿(純度97.1%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；內(nèi)標(biāo)物苯基辣椒堿(純度98%)，來自某委托送檢客戶提供的高純度對照品。

1.2 標(biāo)準溶液的配制

分別準確稱取對照品及內(nèi)標(biāo)物各20.0 mg(精確至0.01 mg)至10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻得到2 000 mg/L的單標(biāo)儲備液，置于棕色瓶中，于-20 ℃保存。取內(nèi)標(biāo)單標(biāo)儲備液適量，用丙酮配制成質(zhì)量濃度為500 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液，置于棕色瓶中，于4 ℃保存；根據(jù)需要，取各待測物的單標(biāo)儲備液適量，用乙腈稀釋成所需濃度的混合標(biāo)準工作液。

1.3 樣品預(yù)處理

準確稱取均勻試樣1.0 g(精確至0.01 g)，置于10 mL聚四氟乙烯離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液(質(zhì)量濃度為500 ng/mL)，充分渦旋混勻，加入8 mL乙腈，渦旋提取3 min，10 000 r/min 離心5 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至10 mL試管；向殘液中加入5 mL乙腈，重復(fù)提取1次，10 000 r/min 離心5 min，合并上清液，于50 ℃水浴中氮吹濃縮至近干，準確加入1 mL乙腈復(fù)溶，超聲30 s，充分渦旋混勻，于-20 ℃冷凍3 h，取上清液過0.22 μm濾膜后，待測定。

1.4 色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：XSelect?HSS PFP(100 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國Waters公司)；流動相：A相為5 mmol/L甲酸銨，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0～5.50 min，35%B；5.50～6.00 min，35%～40%B；6.00～7.50 min，40%～65%B；7.50～7.51 min，65%～100%B；7.51～8.50 min，100%B；8.50～8.51 min，100%～35%B；8.51～10.00 min，35%B。流速：0.45 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；分析時間：10 min。通過六通切換閥控制色譜柱流出液流向：在2.6～8.6 min之間，將流出液切換至質(zhì)譜儀進行分析，其余時間的流出液均被切換至廢液中。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：安捷倫噴射流電噴霧離子(AJS ESI)源；掃描模式：正離子；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；干燥氣(N2)溫度：325 ℃；干燥氣(N2)流量：10.0 L/min；霧化氣(N2)壓力：310 kPa(45 psi)；鞘流氣(N2)溫度：325 ℃；鞘流氣(N2)流量：11.0 L/min；毛細管入口端電壓：4 000 V；噴嘴電壓：500 V；駐留時間：25 ms；碰撞池加速電壓：5 V；優(yōu)化后的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 9種待測物和內(nèi)標(biāo)物的分子式、保留時間及質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Molecular formula,retention times and MS parameters of nine analytes and the internal standard

tR：retention time；CE：collision energy；*quantitative ion；**internal standard

2 結(jié)果與討論

2.1 非正常來源食用油中外源性特征雜質(zhì)成分的確定

食用油與非正常來源食用油的主要成分均為脂肪酸甘油酯。油脂本身含有的微量成分，可稱為內(nèi)源性微量成分；而外源性雜質(zhì)成分，是指油脂在烹飪過程中與食物、調(diào)料等接觸，以及在回收、儲存和加工過程中與包裝物等接觸而引入的微量成分。作者在前期研究[11]中建立了食用油中辣椒素、二氫辣椒素和胡椒堿等外源性雜質(zhì)成分的檢測方法。本文經(jīng)進一步研究，總結(jié)人們?nèi)粘Ｉ钪械某Ｓ谜{(diào)料，將辣椒及其制品中的主要特征成分辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素，胡椒類調(diào)料中的主要特征成分胡椒堿和四氫胡椒堿，姜類調(diào)料中的主要特征成分6-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚，以及花椒類調(diào)料中的主要特征成分羥基-α-山椒素等9種化合物作為食用油的外源性特征雜質(zhì)成分。上述成分不存在于正常來源的食用油中，因此可作為鑒別部分食用油來源正常與否的可靠指標(biāo)。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，胡椒堿、羥基-α-山椒素和四氫胡椒堿為堿性化合物，辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素均為帶酚羥基和含氮官能團的兩性化合物，6-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚均為含酚羥基的酸性化合物，而9種待測物均適于采用電噴霧離子源測定。

在電噴霧離子源的正、負離子模式下，分別對9種待測物標(biāo)準溶液作一級質(zhì)譜全掃描分析，比較了揮發(fā)性有機酸(甲酸和乙酸)及其銨鹽(甲酸銨和乙酸銨)對化合物離子化的影響。結(jié)果表明，胡椒堿等堿性化合物適合在正離子模式下測定，獲得準分子離子[M+H]+和加合離子[M+Na]+，且加合離子在揮發(fā)性有機酸存在下響應(yīng)極高，而使用銨鹽時豐度顯著降低；辣椒素等兩性化合物在正、負離子模式下，分別獲得準分子離子[M+H]+和[M-H]-，以及[M+Na]+、[M+K]+和[M+Cl]-等加合離子，但正離子的響應(yīng)明顯優(yōu)于負離子，且使用銨鹽亦會抑制正離子模式下加合離子的生成；6-姜酚和10-姜酚等姜辣素在使用銨鹽時，獲得[M+H-H2O]+和[M-H]-兩個基峰離子以及豐度比低于10%的[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+H]+和[M+Cl]-等離子，而使用揮發(fā)性有機酸時，正離子基峰為[M+Na]+，負離子響應(yīng)下降明顯；姜烯酚類化合物6-姜烯酚在上述4種流動相添加劑條件下，正離子基峰均為[M+H]+。姜辣素和姜烯酚類化合物的實驗結(jié)果與文獻[16]報道一致。實驗最終選擇[M+H-H2O]+作為6-姜酚和10-姜酚的母離子，[M+H]+作為其余7種待測物的母離子。

另外，某些化合物極易發(fā)生源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離(Collision-induced dissociation，CID)，如合成辣椒素易碎裂生成m/z122.1、m/z137.1等離子，6-姜烯酚、6-姜酚和10-姜酚等易碎裂生成m/z122.1、m/z137.1、m/z177.1、m/z117.1、m/z145.1及m/z149.1等離子，通過進一步優(yōu)化毛細管出口端電壓(Fragmentor)，可減少源內(nèi)CID，使得各化合物的母離子響應(yīng)最佳。然后對母離子作子離子全掃描分析，根據(jù)歐盟2006/657/EC決議中有關(guān)質(zhì)譜分析不得少于4個識別點的規(guī)定[17]，選取豐度較大的2個子離子作為特征碎片離子，通過MRM模式優(yōu)化碰撞能量使其響應(yīng)最佳。優(yōu)化后的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。最終根據(jù)色譜保留時間和2對MRM離子對的豐度比對各組分進行定性鑒別，以MRM定量離子對的峰面積按內(nèi)標(biāo)法進行定量測定。

圖1 20 μg/L混合標(biāo)準溶液的總離子流(TIC)色譜圖Fig.1 Total ion current(TIC) chromatogram of mixed standard solution(20 μg/L)peak numbers are the same as those in Table 1

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇由9種待測物的化學(xué)結(jié)構(gòu)可知，其極性均為中等偏小，適合采用反相色譜分析。另外，為實現(xiàn)其中結(jié)構(gòu)相近的幾組同類成分的良好分離，對比了具有不同選擇性的色譜柱Poroshell 120 HPH-C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)(A)、Poroshell 120 Bonus-RP(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)(B)、XSelect?HSS PFP(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)(C)和Poroshell 120 PFP(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)(D)的分離效果。結(jié)果表明：色譜柱A、B和D均未能實現(xiàn)合成辣椒素和辣椒素、胡椒堿和四氫胡椒堿的良好分離，且不能有效分離胡椒堿(m/z286.2)的干擾離子對；而色譜柱C對9種待測物及胡椒堿的干擾離子均有良好的分離，除合成辣椒素和辣椒素外，其余成分均實現(xiàn)基線分離(見圖1)，因此選擇XSelect?HSS PFP(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)作為色譜分析柱。

2.3.2 流動相的選擇結(jié)合質(zhì)譜條件的優(yōu)化結(jié)果，采用選定的色譜柱，分別考察了以乙腈或甲醇為有機相，5 mmol/L甲酸銨或5 mmol/L乙酸銨為水相時的色譜分離情況。結(jié)果表明，上述兩種水相對待測物的分離效果無明顯差異，但使用甲酸銨時化合物的質(zhì)譜響應(yīng)略高；以甲醇為有機相需要延長分析時間來改善色譜分離度。綜合考慮，選擇5 mmol/L甲酸銨為水相，乙腈為有機相，經(jīng)反復(fù)試驗確定“1.4.1”所述的梯度洗脫程序，可在10 min內(nèi)獲得良好的分離效果。圖2為9種待測物混合標(biāo)準溶液的MRM色譜圖。

2.4 樣品前處理條件的優(yōu)化

食用油中主要成分脂肪酸甘油酯的極性較小，易溶于正己烷等弱極性有機溶劑，而9種待測物的極性也為中等偏弱，因此提取難度較大。為有效提取目標(biāo)物和減少油脂帶出，選取極性較大的甲醇、乙醇、乙腈等有機溶劑進行試驗。結(jié)果表明，3種溶劑均能高效提取食用油中的9種待測物，提取率相當(dāng)，但對油脂的帶出量，則乙醇最多，甲醇次之，乙腈最少。因此選用乙腈為提取溶劑。此外，嘗試使用乙腈飽和正己烷進行除脂，有一定凈化效果，但目標(biāo)物損失嚴重。最終選用低溫冷凍的方式，可減少樣液中的部分油脂，獲得較理想的提取效果。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

與其他分析方法不同，質(zhì)譜分析尤其是液相色譜-質(zhì)譜分析方法通常存在基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect,ME)[18]，影響方法精密度和準確度。本研究采用提取后添加的方式考察各待測物的絕對基質(zhì)效應(yīng)，即采用純?nèi)軇┮译婧涂瞻谆|(zhì)溶液為稀釋劑，分別配制6個質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準溶液上機測定，按公式ME=B/A計算(B為基質(zhì)匹配標(biāo)準曲線的斜率，A為純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準曲線的斜率)，ME比值越接近1，說明基質(zhì)效應(yīng)越小，反之亦然。由表2可知，6-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚存在較大的基質(zhì)效應(yīng)(ME<0.8)，其余待測物均無明顯的基質(zhì)效應(yīng)(ME值均接近1)。因此，為消除或補償基質(zhì)效應(yīng)給定量帶來的偏差，本法選擇食用油中不存在、人工合成的作為船舶防污用漆的辣椒堿類似物——苯基辣椒堿為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法進行定量校正。

2.6 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下，對6個質(zhì)量濃度水平的系列混合標(biāo)準溶液(含25 μg/L內(nèi)標(biāo)物)進行測定。以各組分的MRM定量離子對峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量離子對峰面積的比值為縱坐標(biāo)(y)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x,μg/L)繪制標(biāo)準曲線，得到線性回歸方程。由表2可知，各待測物均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 5～0.999 7。采用標(biāo)準添加法測定，以定量離子對的信噪比(S/N)不小于3確定待測物的檢出限(LOD)，S/N不小于10確定待測物的定量下限(LOQ)，得到9種待測物的LOD為0.02～0.10 μg/kg，LOQ為0.05～0.25 μg/kg(見表2)。

表2 9種待測物的基質(zhì)效應(yīng)、線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量下限Table 2 Matrix effects,linear equations,correlation coefficients(r2),linear ranges,LODs and LOQs of nine analytes

(續(xù)表2)

No.AnalyteMatrix effectLinear equationr2Linear range(μg/L)LOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)7Piperine0.976y=0.058 3x+0.000 70.999 70.05～500.020.0586-Shogaol0.740y=0.012 6x-0.003 40.999 60.20～2000.050.20910-Gingerol0.697y=0.014 5x-0.009 00.999 10.25～2500.100.25

y:peak area ratio of the quantitative ions of analyte to the internal standard；x:mass concentration(μg/L)

2.7 回收率與相對標(biāo)準偏差

取空白樣品，在低、中、高3個添加水平下進行加標(biāo)回收試驗，每個加標(biāo)水平按本法處理后測定，平行測定6次，計算待測物的平均回收率和相對標(biāo)準偏差(RSD，n=6)。由表3可知，9種待測物的平均回收率為68.2%～104%，RSD為2.2%～12%。結(jié)果表明，方法具有較好的準確度和精密度。

表3 9種待測物的平均回收率與相對標(biāo)準偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and relative standard deviations(RSD) of nine analytes(n=6)

圖3 陽性樣品的總離子流(TIC)色譜圖Fig.3 Total ion current(TIC) chromatogram of a positive sample

2.8 實際樣品測定

應(yīng)用本法篩查了購自本地區(qū)市郊某農(nóng)貿(mào)市場的20批次食用油樣品，其中1個批次樣品檢出較高含量的辣椒素(37.2 μg/kg)及二氫辣椒素(26.3 μg/kg)，其余待測化合物均未檢出，陽性樣品的總離子流色譜圖見圖3。

3 結(jié) 論

本研究建立了UHPLC-MS/MS同時快速測定食用油中來源于4類調(diào)料的9種外源性特征雜質(zhì)的分析方法。采用PFP色譜柱在10 min內(nèi)實現(xiàn)了9種待測物的良好分離。與現(xiàn)有方法相比，該法樣品前處理更為簡便、高效，采用內(nèi)標(biāo)法校正，定量更加準確可靠，是同時測定食用油中難揮發(fā)外源性特征雜質(zhì)種類最多的方法。該法適用于食用油的質(zhì)量安全監(jiān)測，為非正常來源食用油的鑒別提供了可靠方法，可為政府相關(guān)部門提高食用油監(jiān)管水平提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。