施云峰，薛 巍

(1.暨南大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué) 分析測試中心，廣東 廣州 510632)

電子顯微技術(shù)(Electron microscopy，EM)是利用電子光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行顯微成像與原位分析的技術(shù)。電子的德布羅意波長更短，因此使用電子束光源的顯微鏡具有更高的分辨率。另外，電子束與樣品作用能激發(fā)出特征X射線、陰極熒光、俄歇電子等有價值的信號，可應(yīng)用于原位元素分析。自20世紀(jì)30年代誕生了第一臺電子顯微鏡開始，隨著技術(shù)的發(fā)展，電子顯微鏡的分辨能力由最初的50 nm顯著提升至亞納米的原子尺度(配備球差矯正器)[1]，附件功能也得到了極大拓展，如：可進(jìn)行實驗并實現(xiàn)原位觀察的樣品傳送裝置[2]；用于元素組成與分布測試的波長色散譜儀(WDS)[3]、X射線能譜儀(EDS)[4]、俄歇電子能譜儀(AES)[5]、電子能量損失譜儀(EELS)[6]；用于晶體樣品的電子衍射與高分辨成像[7]；用于冷凍電鏡(Cryo-EM)低襯度成像的直接電子檢測成像系統(tǒng)等[8]。

現(xiàn)代EM的推廣與應(yīng)用，極大地推進(jìn)了科學(xué)進(jìn)步。尤其在生物納米材料研究領(lǐng)域，電子顯微鏡更是重要的分析與表征工具，可應(yīng)用于指導(dǎo)新穎納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、揭示材料與細(xì)胞/組織相互作用并發(fā)揮功能的機(jī)制[9]。本文結(jié)合研究實例，重點介紹了適用于生物納米材料研究的電子顯微結(jié)構(gòu)表征與原位分析測試方法。

1 生物納米材料的定義與分類

生物納米材料是指一類應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷與治療，人體組織與受損器官結(jié)構(gòu)與功能重建、恢復(fù)與增強(qiáng)的功能性材料[10]。按物理化學(xué)屬性可分為金屬材料、無機(jī)非金屬材料、有機(jī)高分子材料及其復(fù)合材料等；按來源可分為天然材料與合成材料兩大類。其生物安全性與功能性顯著依賴于顯微結(jié)構(gòu)特征[11-12]。

2 電子顯微鏡的分類及其應(yīng)用特點

透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)與掃描電子顯微鏡(Scanning electron micro scope,SEM)是開展材料科學(xué)研究的兩大利器?；赥EM的顯微形貌分析、電子衍射與高分辨成像、元素分析可應(yīng)用于表征納米晶體(如金屬及其氧化物[13]、氧化硅[14]等)、納米片層與納米管(如石墨烯[15]、黑磷[16]、碳納米管[4]等)、金屬-有機(jī)物骨架材料(MOFs)[17]、聚合物納米結(jié)構(gòu)[18](膠束、微球、聚合物納米涂層等)以及生物質(zhì)膜偽裝納米載體[19]等；配備表面分析附件的SEM，可應(yīng)用于表征樣品的表面顯微結(jié)構(gòu)，測算其孔隙率和粗糙度，評價表面處理、改性、吸附的效果。此外，電子顯微鏡也可在細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平表征細(xì)胞或組織對納米材料的識別、吞噬，以及材料進(jìn)入胞漿后的轉(zhuǎn)運、藥物釋放與降解過程，用于精確評價生物安全性并驗證預(yù)設(shè)的治療效果[20]。

3 應(yīng)對生物納米材料特殊性的電子顯微實驗方法

生物納米材料涵蓋面廣，理化性能復(fù)雜多樣，對樣品制備方法與表征測試條件也有不同的要求。特別針對有機(jī)高分子樣品(低電子襯度、束流敏感、表面不導(dǎo)電)、磁性樣品、介孔樣品、材料與細(xì)胞或組織復(fù)合的樣品，需對常規(guī)實驗方法進(jìn)行優(yōu)化。

3.1 TEM表征有機(jī)高分子樣品

絕大多數(shù)有機(jī)高分子基生物納米材料具有低電子襯度、束流敏感、易受輻照損傷的特點，如蛋白顆粒、由兩親聚合物自組裝形成的膠束、脂質(zhì)體等。常規(guī)應(yīng)對策略有：①增加入射電子束的劑量(Dose rate)，這樣可增強(qiáng)成像襯度，但也會增加電子輻照損傷，破壞樣品結(jié)構(gòu)；②使用重金屬染液(磷鎢酸、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛等)增強(qiáng)樣品與背景的襯度差，缺點是會導(dǎo)致分辨率降低。如Chetanachan等[21]報道了脂質(zhì)體的TEM樣品負(fù)染色技術(shù)(Negative staining)，通過優(yōu)化染色條件(2.5%醋酸雙氧鈾，30 s)，成功表征了雙層膜結(jié)構(gòu)。③20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了冷凍電子顯微鏡技術(shù)(Cryo-electron microscopy,Cryo-EM)。通過對分散有納米顆粒的懸浮液進(jìn)行快速冷凍處理，并使用冷臺承載樣品保持低溫氛圍，進(jìn)行TEM成像。Cryo-EM可使冷凍樣品的輻照損傷被有效控制，配合使用先進(jìn)的直接電子檢測器可捕獲極低襯度的圖像信息。Bates等[22]采用冷凍電鏡斷層成像技術(shù)(Cryo-electron tomography,Cryo-ET)研究含有聚氧化乙烯(PEO)的崁段聚合物在水中自組裝形成膠束和囊泡的過程，并使用液態(tài)乙烷將樣品快速冷凍至玻璃態(tài)，在低束流(Low dose)模式下直接獲得了高襯度像。

3.2 SEM表征不導(dǎo)電樣品

由于“荷電效應(yīng)”，表面絕緣的SEM樣品表征前需進(jìn)行導(dǎo)電化處理。雖然使用高真空噴涂鉑(Pt)較離子濺射金(Au)對樣品極表面納米結(jié)構(gòu)的遮蔽效果更小，但不可避免地會在高放大倍數(shù)下顯現(xiàn)出偽像。如何實現(xiàn)不導(dǎo)電生物納米材料的直接表征，是個亟待解決的技術(shù)難題。已報道方法有：①通過特殊的電子光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計，降低電子束的著陸電壓，在不損失分辨率的前提下縮短電子束在樣品表面的注入深度，減少、減緩負(fù)電荷的累積。②通過對樣品表面吹氣中和荷電的方法(Focal gas injection-based charge compensation)，直接表征表面絕緣的樣品。如Ellisman等[23]報道了對樣品表面局部吹打氮氣中和荷電的方法，實現(xiàn)了對不導(dǎo)電樣品的直接表征。

3.3 磁性樣品的表征

磁性納米粒子(如四氧化三鐵(Fe3O4)等)是一類重要的生物納米材料，可應(yīng)用于磁場介導(dǎo)的靶向釋放體系[24]、磁熱療[25]等。如何利用電子顯微鏡安全、精確地表征磁性納米材料，具有較強(qiáng)的挑戰(zhàn)性。由于傳統(tǒng)電鏡光路系統(tǒng)使用多級磁透鏡對電子束進(jìn)行匯聚，在接近樣品的極靴位置會產(chǎn)生磁場泄漏，易吸附磁性納米顆粒，嚴(yán)重影響電鏡的分辨率與使用安全。應(yīng)對方法包括：①對樣品進(jìn)行消磁處理，缺點是可能會改變樣品顯微形貌。②通過裝備洛倫茲透鏡(遠(yuǎn)離樣品的磁透鏡)代替物鏡的成像功能，TEM可直接觀察磁性樣品[26]。③ZEISS公司專利Gemini鏡筒設(shè)計，使用靜電透鏡和電磁透鏡復(fù)合的電子光學(xué)系統(tǒng)，能顯著減少極靴處的磁泄漏。④不具備升級儀器條件時，可通過對樣品制備過程進(jìn)行優(yōu)化，如使用合頁銅網(wǎng)包夾TEM樣品，或者將SEM樣品深嵌入導(dǎo)電膠層，防止樣品飛濺。

3.4 生物納米材料的三維結(jié)構(gòu)表征

由于成像原理的限制，傳統(tǒng)TEM只能利用非彈性散射電子成平面投影像。雖然通過傾轉(zhuǎn)樣品可獲得連續(xù)的投影襯度，但是受限于樣品漂移和低信噪比，三維重構(gòu)質(zhì)量不高。SEM二次電子(SE2)檢測器可獲得樣品近表面的三維結(jié)構(gòu)信息，但受景深限制，對大跨度復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)與被表面遮蔽的孔隙與鑲嵌結(jié)構(gòu)的表征效果較差。因此，如何精確、高效地獲取生物納米材料的三維結(jié)構(gòu)信息具有較強(qiáng)的研究價值。當(dāng)前主流的解決方案包括：

①連續(xù)切片掃描電子顯微技術(shù)(Serial block-face scanning electron microscopy)：將切片減薄系統(tǒng)置于SEM樣品室內(nèi)，對包埋固定的樣品進(jìn)行厚度可控的表面犧牲處理；吹打保護(hù)氣消除荷電，可直接對新暴露面進(jìn)行SEM表征；收集連續(xù)圖像信息，重構(gòu)納米尺度的大容量三維結(jié)構(gòu)[27-28]。該技術(shù)可為評價納米顆粒的生物相容性、示蹤納米載體在細(xì)胞內(nèi)、組織間的傳遞與降解過程，提供更直觀、準(zhǔn)確的信息。

②冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)在近年來得到了飛速發(fā)展。2017年諾貝爾化學(xué)獎授予了對發(fā)展與推廣現(xiàn)代冷凍電鏡技術(shù)做出杰出貢獻(xiàn)的3位科學(xué)家，以表彰其革新冷凍制樣方法，開發(fā)并推廣低電子襯度樣品高清成像技術(shù)，創(chuàng)新軟件算法應(yīng)用于三維重構(gòu)。Cryo-EM單顆粒重構(gòu)技術(shù)適合表征結(jié)構(gòu)均一性好的蛋白質(zhì)、病毒、DNA顆粒。該法結(jié)合了襯度傳遞函數(shù)的修正，樣品投影數(shù)據(jù)的篩選，二維投影數(shù)據(jù)的分類和降噪，三維模型的重構(gòu)與優(yōu)化等步驟，能夠獲得近原子尺度的高分辨像。Cryo-ET通過傾轉(zhuǎn)樣品，獲得高質(zhì)量的連續(xù)二維投影像，適用于表征結(jié)構(gòu)均一性差的脂質(zhì)體、聚合物粒子。Stewart[29]綜述了使用Cryo-EM和Cryo-ET表征蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)、聚合物納米顆粒的制樣方法與圖像處理流程。

圖1 平插式與斜插式能譜探頭的位置示意圖[30]Fig.1 Geometry of the annular and conventional SDD EDS[30]

3.5 低電壓、低束流模式下的能譜測試

基于TEM/SEM的能譜分析，可原位測試生物納米材料的元素組成與分布。但對于束流敏感的有機(jī)高分子樣品，必須降低束流和加速電壓，這樣會損失能譜計數(shù)率，降低測試的靈敏度和準(zhǔn)確度。應(yīng)對策略包括：①使用大面積的能譜探測器，可增加入射X光子的接收率、改善信噪比，但同時也成倍地增加了生產(chǎn)成本。②平插式能譜(如Bruker QUANTAX FlatQUAD)將環(huán)形探測器置于極靴與樣品間，較傳統(tǒng)斜插方式能獲得更大的接收立體角(Solid angle)。其優(yōu)點在于既使低束流或極低束流(<10 pA)模式下，仍能獲得高計數(shù)率和高能量分辨率，對于表面不平整的樣品還能消除“陰影效應(yīng)”。Hodoroaba等[30]對比了平插方式與斜插方式在能譜探測器設(shè)置、信號接收效率方面的差異(圖1)。平插式能譜具有更優(yōu)的信噪比、空間分辨率，在低加速電壓下仍能獲得高計數(shù)率，可對束流敏感樣品進(jìn)行更精準(zhǔn)的化學(xué)分析。

3.6 細(xì)胞與組織超微結(jié)構(gòu)的表征

生物納米材料的安全性與功能性評價，包括細(xì)胞實驗與動物實驗。電子顯微鏡可應(yīng)用于表征亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。保存活細(xì)胞與組織的結(jié)構(gòu)、脫除水分是制樣過程的關(guān)鍵。常規(guī)化學(xué)固定、梯度脫水、樹脂包埋、超薄切片與染色的方法，具有操作便捷、適用面廣的優(yōu)點，但化學(xué)固定劑(如戊二醛、多聚甲醛等)會破壞樣品的生物活性，不利于開展后續(xù)生化實驗；樹脂經(jīng)滲透過程，替代了部分組織和細(xì)胞內(nèi)容物，發(fā)揮支撐增強(qiáng)作用的同時也一定程度上改變了超微結(jié)構(gòu)。高壓冷凍、冷凍替代、冷凍超薄切技術(shù)，雖避免了化學(xué)試劑使用，可兼顧保存樣品的結(jié)構(gòu)與生物活性，但對制樣設(shè)備與操作也提出了更高的要求。

4 展 望

憑借著技術(shù)革新，電子顯微鏡的分辨力極限不斷被刷新，使得在原子尺度進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)表征變成了可能；同時附件的功能也不斷得到拓展，發(fā)展出一系列高精度的原位分析測試技術(shù)。“看得更清”、“測得更準(zhǔn)”的現(xiàn)代電子顯微技術(shù)，將對生物納米材料學(xué)科的發(fā)展做出更大貢獻(xiàn)。

未來電子顯微技術(shù)的發(fā)展方向?qū)⒏嗉杏冢孩俑叻直妗⒊蟪叽鐖D像的拼接與大容量三維結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。可更直觀、準(zhǔn)確地表征新穎的微納結(jié)構(gòu)，及其與細(xì)胞/組織作用發(fā)揮功能的情況；②對動態(tài)實驗過程進(jìn)行原位表征與測試。如將液體樣品封閉在對電子束透明的薄層中，研究蛋白、多肽、聚合物的自組裝過程；③與其他成像技術(shù)(激光共聚焦(LSCM)、原子力顯微鏡(AFM)等)的聯(lián)用。開發(fā)兼容的軟件與可拼接硬件系統(tǒng)，預(yù)計可實現(xiàn)活細(xì)胞/組織的精準(zhǔn)定位、整合AFM的單分子尺度力學(xué)測量數(shù)據(jù)(彈性、硬度、黏度和表面電荷密度)，構(gòu)建大信息容量的復(fù)合圖像。