周 凡,姚 政,陳成熾,李金花,楊培慧*

(1.暨南大學(xué) 化學(xué)與材料學(xué)院,廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510632)

細(xì)胞傳感器是21世紀(jì)迅速發(fā)展的一種生物檢測技術(shù)，成為生物傳感器領(lǐng)域的一大研究熱點(diǎn)[1]。它通過將細(xì)胞固定在傳感界面作為識別元件或研究對象，使其與電極或其他信號元件組合，從而對被分析物的性質(zhì)和功能進(jìn)行分析研究，在生物醫(yī)學(xué)、食品安全和藥物篩選等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[2]。細(xì)胞傳感器具有實(shí)時、動態(tài)、特異性高、分析簡便快速等特點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)免疫化學(xué)和核酸等檢測方法費(fèi)時、操作復(fù)雜且不安全等不足，它與電致發(fā)光技術(shù)結(jié)合所構(gòu)建的電致發(fā)光細(xì)胞傳感器目前成為了生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

電致發(fā)光(Electrogenerated chemiluminescence，ECL)或電化學(xué)發(fā)光是一種由電化學(xué)反應(yīng)引起的發(fā)光現(xiàn)象，對電極施加給定電壓使電極表面發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生的電生物質(zhì)彼此之間或與體系中某些組分經(jīng)過電子傳遞作用形成激發(fā)態(tài)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)[3]。一方面，它是化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物，兼具兩者的優(yōu)點(diǎn)(如靈敏度高、動力學(xué)范圍寬、操作簡單等)[4]。另一方面，ECL作為一種發(fā)光技術(shù)，相對于其他發(fā)光方法具有獨(dú)特優(yōu)勢。與光譜學(xué)分析法相比，ECL無需借助外來光源激發(fā)，降低了背景噪聲；與化學(xué)發(fā)光法相比，它可以通過定向修飾電極提高選擇性。近年來，ECL技術(shù)在腫瘤細(xì)胞濃度檢測、細(xì)胞表面或內(nèi)部生物分子分析、細(xì)胞凋亡以及其它細(xì)胞功能監(jiān)測、單細(xì)胞分析等方面展現(xiàn)了獨(dú)特優(yōu)勢，結(jié)合納米材料和分析設(shè)備的設(shè)計(jì)及應(yīng)用，促進(jìn)了ECL細(xì)胞傳感器的進(jìn)一步發(fā)展。本文將簡要介紹電致發(fā)光探針，并結(jié)合本課題組的研究工作和近年來的文獻(xiàn)論述電致發(fā)光細(xì)胞傳感器在腫瘤細(xì)胞定量分析、腫瘤標(biāo)志物分析、單細(xì)胞分析和細(xì)胞功能分析等方面的應(yīng)用。

1 電致發(fā)光探針

目前已報道的電致發(fā)光體系有很多種，根據(jù)發(fā)光試劑的差異性可分為以下3類[5]：無機(jī)金屬配合物、有機(jī)化合物和納米材料等。無機(jī)金屬配合物主要包含釕配合物和銥配合物等；有機(jī)化合物主要包括魯米諾類、吖啶類以及多環(huán)芳烴類等；近年來，納米材料發(fā)光體(如半導(dǎo)體納米晶體、貴金屬納米簇和碳納米材料)作為新型的ECL體系也得到了迅速發(fā)展。

1.1 三聯(lián)吡啶釕

1.2 魯米諾

魯米諾(Luminol)作為化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域中常用的發(fā)光試劑，具有電化學(xué)發(fā)光性質(zhì)以及發(fā)光量子產(chǎn)率較高、激發(fā)電位低、試劑便宜、毒性小等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于電致發(fā)光生物傳感領(lǐng)域。其電致發(fā)光機(jī)理主要分為陰極和陽極電致發(fā)光[10]；魯米諾陰極ECL的產(chǎn)生通常涉及電化學(xué)還原溶解氧生成活性氧的過程，由于魯米諾在負(fù)電位下不能在電極上氧化，其ECL信號非常弱；魯米諾陽極ECL是以H2O2作為共反應(yīng)劑在堿性溶液中進(jìn)行，發(fā)光機(jī)理為Luminol先解離成陰離子并進(jìn)行電化學(xué)氧化，與H2O2電氧化生成的過氧化氫自由基或超氧陰離子進(jìn)一步反應(yīng)形成激發(fā)態(tài)分子3-氨基鄰苯二甲酸鹽，之后返回至基態(tài)產(chǎn)生發(fā)光信號。Shi等[11]通過DNA雙鏈組裝AuNPs，既作為Luminol/H2O2反應(yīng)的催化劑，又作為陽極溶解探針Ag化學(xué)還原的種子，利用Ag@Au猝滅Luminol的ECL發(fā)射及信號恢復(fù)來反映陽極溶解程度，通過監(jiān)測細(xì)胞在陰極上孵育前后的ECL恢復(fù)時間來定量分析腫瘤細(xì)胞。Zuo等[12]采用Luminol電致發(fā)光法同時測定單個細(xì)胞質(zhì)膜中活性膽固醇和非活性膽固醇的含量。Ge等[13]設(shè)計(jì)了一種由封閉雙極電極組成的紙質(zhì)分析裝置，基于Luminol產(chǎn)生的ECL信號與細(xì)胞釋放出的H2O2量成正比來檢測MCF-7乳腺癌細(xì)胞。

1.3 納米材料

1.3.1 量子點(diǎn)量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)由于量子產(chǎn)率高、抗光漂白穩(wěn)定性好以及發(fā)光具有尺寸依賴性，近年來將其作為ECL發(fā)光探針受到廣泛關(guān)注。在QDs-ECL過程中，電極表面產(chǎn)生的物質(zhì)涉及高能電子傳遞反應(yīng)，并形成發(fā)光激發(fā)態(tài)，主要有兩種發(fā)光機(jī)制[14]：湮滅型和共反應(yīng)劑型。湮滅型ECL要求自由基QDs在與相反電荷的QDs發(fā)生碰撞時，需具備一定的化學(xué)穩(wěn)定性和長期保持其帶電狀態(tài)等條件來轉(zhuǎn)移電荷，此外所施加的電位必須足夠保證電極表面同時產(chǎn)生帶正、負(fù)電荷的QDs。共反應(yīng)劑型ECL涉及發(fā)光體與共反應(yīng)劑在電極上進(jìn)行單向電位掃描反應(yīng)，根據(jù)電極表面氧化和還原過程分為氧化-還原反應(yīng)和還原-氧化反應(yīng)，常用共反應(yīng)劑有亞硫酸鹽、草酸鹽、過硫酸鹽以及溶解氧等。共反應(yīng)劑的引入克服了溶劑電勢限制并產(chǎn)生了比湮滅反應(yīng)更強(qiáng)的ECL信號，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器構(gòu)建。Jie等[15]利用AuNPs上的多支鏈DNA雜交鏈反應(yīng)制備了一種基于CdSe/ZnSQDs的信號放大的電致發(fā)光探針，用于檢測腫瘤細(xì)胞。Ding等[16]以CdTeQDs和Luminol為雙發(fā)光體，構(gòu)建了雙模態(tài)ECL系統(tǒng)用于MCF-7細(xì)胞的檢測。

1.3.2 碳納米材料近年來，碳納米材料尤其是碳納米點(diǎn)(CNDs)、石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)和石墨碳氮化物(g-C3N4)成為一種新型ECL發(fā)光體。CNDs是尺寸小于10 nm的球形點(diǎn)，由以sp2碳為主的無定形或結(jié)晶的核和帶有含氧基團(tuán)的氧化碳?xì)咏M成[17]；GQDs是一種厚度介于3～20 nm之間的石墨烯納米薄片，其晶體網(wǎng)格由碳原子組成，呈蜂窩狀排列[18]；g-C3N4尺寸約為數(shù)百納米，為二維材料，由于C和N的sp2雜化而具有p-共軛石墨晶面結(jié)構(gòu)[19]。碳納米材料的ECL發(fā)光行為類似于量子點(diǎn)，其優(yōu)越性在于無毒、成本低，具有良好的導(dǎo)電性、化學(xué)和光穩(wěn)定性，因此被認(rèn)為在生物分析領(lǐng)域極具應(yīng)用前景。Liu等[20]在紙工作電極上生長Au納米花用于固定抗體以捕獲MCF-7細(xì)胞，負(fù)載于Au納米籠表面的GQDs作為ECL探針，構(gòu)建夾心式細(xì)胞傳感器檢測MCF-7細(xì)胞表面的乳腺癌特異性標(biāo)志物CA153。Xu等[21]將C3N4QDs/g-C3N4納米片復(fù)合材料與二茂鐵標(biāo)記的適配體偶聯(lián)導(dǎo)致ECL信號猝滅，引入目標(biāo)物血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)使其信號恢復(fù)，用于定量測定PDGF-BB。

2 電致發(fā)光細(xì)胞傳感器及其應(yīng)用

2.1 腫瘤細(xì)胞定量分析

癌癥是當(dāng)前危害人類健康的重大疾病，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確、靈敏的檢測對于該疾病的診斷和治療具有重要意義。ECL分析法由于背景值低、成本低且操作簡單而日益受到關(guān)注，目前，基于ECL技術(shù)的各種分析方法[25]被廣泛用于腫瘤細(xì)胞定量分析，如共振能量轉(zhuǎn)移，利用生物識別反應(yīng)產(chǎn)生的空間位阻降低信號，產(chǎn)生或消耗共反應(yīng)劑影響ECL發(fā)射強(qiáng)度，通過電子轉(zhuǎn)移方式減弱或增強(qiáng)ECL性能等。

圖1 選擇性檢測腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞表面聚糖的ECL生物傳感器結(jié)構(gòu)[26]Fig.1 Configuration of ECL biosensor for selective detection of cancer cell and cell surface carbohydrate profiling[26]

圖2 雙電化學(xué)發(fā)光信號示意圖[43]Fig.2 Schematic illustration of the dual electrochemiluminescence signal system[43]

2.2 腫瘤標(biāo)志物分析

腫瘤標(biāo)志物存在于腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展過程中，由機(jī)體與腫瘤細(xì)胞相互作用產(chǎn)生或由腫瘤細(xì)胞直接合成、分泌，是一種正常細(xì)胞中含量很低或不存在的具有生物活性的特異性物質(zhì)[35]。按照其自身性質(zhì)可分為胚胎類抗原、糖類糖蛋白抗原、酶及蛋白類、激素類和循環(huán)核酸類。與正常生命體相比，腫瘤患者體內(nèi)與腫瘤相關(guān)的標(biāo)志物表達(dá)異常，因此，對腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測在腫瘤預(yù)防、早期診斷、指導(dǎo)治療和預(yù)后判斷等方面具有重要作用[36]。

通常，細(xì)胞表面會表達(dá)一些與疾病相關(guān)的生物分子，通過對細(xì)胞表面多種標(biāo)志物進(jìn)行檢測，有助于提高對疾病早期診斷的精準(zhǔn)率。Su等[41]采用大孔金紙工作電極，以AuPd納米粒子為信號放大器，CdTeQDs和Luminol作為ECL探針與α-甲胎蛋白和CEA的抗體連接，雙探針發(fā)出的ECL信號被限制在有限的電位窗口內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)對MCF-7細(xì)胞表面對應(yīng)抗原的同時檢測。Lü等[42]在CNNS(碳氮納米板)-AuNPs 和S-CNNS(含硫碳氮納米板)-AuNPs固定的電極上分別組裝CA19-9抗體和間皮素(MSLN)抗體，構(gòu)建波長分辨的多路復(fù)用ECL生物傳感器，在電極界面同時檢測了胰腺癌生物標(biāo)志物CA19-9和MSLN。Yang等[43]采用PANI電聚合修飾氧化銦錫(ITO)電極上的兩個空間分辨區(qū)，并在其表面加入AuNPs，增強(qiáng)傳感界面的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性，將MUC1適配體固定在AuNPs上，捕獲MUC1陽性的MCF-7細(xì)胞，Au@Luminol和CdSQDs組合使用以構(gòu)建在正、負(fù)電位(+0.5 V和-1.2 V)同時發(fā)光的雙信號探針，與Con A和EGF共價連接，用于檢測MCF-7細(xì)胞表面過表達(dá)的甘露糖(Mannose)和EGFR，對細(xì)胞檢測范圍為102～1.0×106cells/mL,檢測限為20 cells/mL，每個細(xì)胞表面Mannose和EGFR的平均表達(dá)量分別為1.2×106、0.86×105(如圖2)。在此基礎(chǔ)上，Yang等[44-45]利用CQDs、CdSQDs和Luminol構(gòu)建電位可分辨的高靈敏電致發(fā)光探針，分別標(biāo)記二抗，采用夾心式檢測模式對結(jié)核病生物標(biāo)志物IFN-γ、IL-2和TNF-α抗原分子進(jìn)行多組分同時檢測，其檢出限為1.6 pg/mL，從而構(gòu)建了一種可同時檢測多組分標(biāo)志物的ECL新方法。

2.3 單細(xì)胞分析

細(xì)胞存在個體差異性即異質(zhì)性，這會造成細(xì)胞在化學(xué)組成、生物活性以及生理響應(yīng)等方面各有不同。可見，在單細(xì)胞水平上進(jìn)行研究能使人們更好地了解細(xì)胞異質(zhì)性及其功能差異性，為探究重大疾病發(fā)病機(jī)理、發(fā)展和治療提供更為可靠的科學(xué)依據(jù)[46]。

圖3 用于觀察單細(xì)胞局部過氧化氫流出的單個TiO2納米顆粒ECL傳感技術(shù)原理圖[48]Fig.3 Schematic process of the ECL sensing of single TiO2 nanoparticles for visualizing local hydrogen peroxide efflux from single cells[48]

圖4 單細(xì)胞分析平臺示意圖[52]Fig.4 Schematic illustration of the proposed single-cell analysis platform[52]

Yang等[52]報道了一種新型的單細(xì)胞傳感分析平臺，將鋅共吸附碳量子點(diǎn)(ZnCQDs)附著在AuNPs上，并以磁珠負(fù)載合成MB@ZnCQDs/AuNPs多重信號放大的固態(tài)電致發(fā)光探針，其信號較水溶性CQDs放大120倍，在該探針上修飾透明質(zhì)酸(HA)用于識別單個乳腺癌細(xì)胞表面CD44分子以及檢測MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，結(jié)果顯示在1～12和1～18個細(xì)胞范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，MDA-MB-231細(xì)胞表面CD44分子的表達(dá)量明顯比MCF-7細(xì)胞高且在同種細(xì)胞株中單個細(xì)胞表面存在差異性(如圖4)。由于細(xì)胞與傳感界面的接觸會降低探針標(biāo)記的有效空間，影響單細(xì)胞傳感器的分析準(zhǔn)確性。為此，Yang等[53]提出了懸空模式單細(xì)胞傳感器，采用不同碳鏈長度的巰基酸(MA-Cx)來調(diào)控ITO/AuNPs/PANI電極界面與單細(xì)胞之間的距離，HA功能化的Au@Cu-PbCQDs被用作ECL和DPV(示差脈沖法)雙功能探針，與MCF-7細(xì)胞表面CD44分子特異性識別，結(jié)果表明，MA-C11構(gòu)建的單細(xì)胞傳感器可獲得最強(qiáng)的ECL信號，較未修飾MA的傳感器提高了(37.5±3.9)%。

2.4 細(xì)胞功能分析

細(xì)胞是生命體的最小單位，是人們研究生物體內(nèi)外過程的一個窗口。通常，細(xì)胞內(nèi)或表面成分的改變會引起細(xì)胞本身乃至機(jī)體的變化，因此對其進(jìn)行監(jiān)測或檢測顯得尤為重要。

Liang等[54]在釕配合物與二氧化硅的復(fù)合納米顆粒上修飾膜聯(lián)蛋白V，用于標(biāo)記MDA-MB-231乳癌細(xì)胞上的磷脂酰絲氨酸(PS)，通過電極上負(fù)載AuNPs并連接Con A捕獲細(xì)胞，研究了紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效率，結(jié)果表明，ECL強(qiáng)度隨藥物濃度的增加而增加，線性范圍為1～200 nmol/L，檢測限為0.3 nmol/L。Wu等[55]在纖維素上生長Au@Pd納米顆粒制備了Au@Pd紙電極，MCF-7細(xì)胞的適配體固定在紙電極上，PtNi@CNDs復(fù)合物用作ECL探針，與Con A連接后特異性識別細(xì)胞表面的甘露糖，通過監(jiān)測不同藥物刺激下MCF-7細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的原位篩選。Wang等[56]利用L012作為ECL發(fā)光探針，通過含水磷脂酶D水解膜磷脂酰絲氨酸(PS)形成絲氨酸，在L-氨基酸氧化酶作用下產(chǎn)生H2O2，誘導(dǎo)電致發(fā)光對單個細(xì)胞凋亡過程中PS的變化進(jìn)行監(jiān)測。Jiang等[57]將三維聚苯胺-植酸導(dǎo)電水凝膠(PANI-PA)固定在GCE上以粘附活細(xì)胞，AgNPs修飾的N-(氨基丁基)-N-(乙基異魯米諾)作為發(fā)光探針附著于PANI-PA表面，在藥物刺激下原位釋放的H2O2增強(qiáng)了電致發(fā)光信號從而對其進(jìn)行檢測。

Yang等[58]將L-半胱氨酸包覆的 CdSQDs固定在聚苯胺納米纖維(PANI-NF)修飾的GCE上，進(jìn)一步在其表面修飾膜聯(lián)蛋白V特異性識別細(xì)胞表面PS，基于早期凋亡細(xì)胞膜表面PS的含量增加導(dǎo)致細(xì)胞與傳感器表面的相互作用增強(qiáng)，利用白藜蘆醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞早期凋亡，構(gòu)建了用于早期凋亡特異性檢測的無標(biāo)簽ECL細(xì)胞傳感器；Yang等[59]在GCE表面固定氧化石墨烯和聚苯胺納米復(fù)合物進(jìn)而附著AuNPs包覆的磁珠用于固定一抗Ab1，以修飾二抗Ab2的CdSQDs作ECL探針，檢測藥物刺激下細(xì)胞分泌的干擾素IFN-γ，線性范圍為0.1～500 pg/mL，最低檢測限為30 fg/mL。Yang等[60]基于鋅共吸附碳量子點(diǎn)，以AuNPs為核、AgNPs為橋梁合成了核殼雙層結(jié)構(gòu)納米探針，構(gòu)建單細(xì)胞傳感器用于研究氧化損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)與血小板的粘附，用抗體修飾探針標(biāo)記受損HUVEC過表達(dá)粘附分子E選擇素，當(dāng)活化血小板表面的糖蛋白與HUVEC表面的粘附分子作用，ECL信號隨粘附血小板數(shù)量的增多而下降，其線性范圍在1～15個血小板之間，用抑制劑處理內(nèi)皮細(xì)胞，其表面粘附分子表達(dá)下調(diào)，血小板與HUVEC的粘附下降，據(jù)此建立了一種可有效動態(tài)監(jiān)測血小板與內(nèi)皮細(xì)胞之間粘附的新方法。

3 結(jié)論與展望

近年來，電致發(fā)光細(xì)胞傳感器在生物分析領(lǐng)域展現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢和潛力，然而，電致發(fā)光探針的數(shù)目和種類有限，多功能傳感器的構(gòu)建仍面臨挑戰(zhàn)。因此，發(fā)展靈敏度高、檢測信號穩(wěn)定、信號可分辨、實(shí)時監(jiān)測的電致發(fā)光細(xì)胞傳感器在多組分檢測、單細(xì)胞分析以及細(xì)胞功能研究等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。電致發(fā)光細(xì)胞傳感器將在生理病理研究以及藥物篩選等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。