楊秋霞，楊運云，劉耀慧，2，向章敏，郭鵬然*

(1.廣東省測試分析研究所，廣東省化學危害應急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東省原位電離質(zhì)譜分析工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070；2.華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州 510642)

靈芝(Ganodermalucidum)屬于擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版所收載的靈芝藥用正品為赤靈芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.) Karst.或紫芝Ganodermasinense的干燥子實體。作為靈芝中的一種，赤靈芝含有大量的生物活性成分[1-2]，主要包括多糖[3-5]、三萜[6-8]、核苷酸、類固醇、甾醇、脂肪酸、蛋白質(zhì)、肽及微量元素[9]，具有抗腫瘤[10-12]、抗糖尿病[13]、免疫調(diào)節(jié)[14-15]、抗菌、抗病毒(包括抗HIV)[16]等多種藥理作用。

目前，主要采用薄層色譜(TLC)、紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、核磁譜(NMR)、質(zhì)譜(MS)[6,17]、高效液相色譜(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)等技術(shù)對赤靈芝進行質(zhì)量控制[18-19]。然而，這些技術(shù)均存在不足，如UV、IR、NMR的專屬性較差；HPLC、HPLC-MS的分析時間長且需要標準品。因此，亟需建立一種快速的赤靈芝化學成分鑒定和指紋圖譜分析新方法。傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR-MS)技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高、準確度好的特點，可直接進行質(zhì)譜分析，大大縮短了分析時間，其超高的質(zhì)量精度和分辨率有利于測定化學成分的精確分子量[20-21]；此外，F(xiàn)TICR-MS還提供了多種碎裂方式，可以獲得非常豐富的離子碎片信息以進行化合物結(jié)構(gòu)的鑒定[22]。

本文建立了一種基于FTICR-MS的赤靈芝化學成分快速鑒定和指紋圖譜分析方法，采用聚類分析和主成分分析等統(tǒng)計學手段對不同產(chǎn)地的赤靈芝進行來源區(qū)分和質(zhì)量評價。該方法可實現(xiàn)赤靈芝藥材的直接、快速、高效分析，在中藥分析和質(zhì)量控制領域有著良好的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

SolariX XR 7.0 T FTICR-MS質(zhì)譜儀(德國Bruker公司，配有電噴霧離子源)，BS 210S電子分析天平(德國Sarrorius公司)，XY-200高速多功能粉碎機(浙江省永康市松青五金廠)，1 mL帶針注射器(宣城市江南醫(yī)療器械有限公司)，0.22 μm微孔濾膜(天津市津騰實驗設備有限公司)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)，DataAnalysis 4.4數(shù)據(jù)處理軟件(德國Bruker公司)。

表1 不同來源赤靈芝樣品的具體信息Table 1 Detailed informations of different Ganoderma lucidum samples

1.2 材料與試劑

甲醇(色譜純，德國默克股份兩合公司)；實驗用水為純化水，由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備；三氟乙酸鈉校準溶液(NaTFA)、芥子酸(美國Sigma-Aldrich公司)；標準品均購自中國藥品生物制品鑒定所；原兒茶酸(批號：110809-201205)、檸檬酸(批號：W142449191102)、赤靈芝樣品購自當?shù)夭煌幍?，具體信息見表1。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI離子源)，負離子掃描模式，掃描質(zhì)荷比范圍：m/z100～1 000；噴霧氣壓力(Nebulizer pressure)：40 kPa；干燥氣體(Dry gas)：氦氣，流速：4.0 L/min；干燥氣溫度(Drying gas temperature)：200 ℃；噴霧電壓(Spray capillary voltage)：4.0 kV；采樣大小為4 M(兆)，累加次數(shù)16次；二級質(zhì)譜采用碰撞誘導解離(Collision-induced dissociation，CID)方式進行母離子碎裂，碰撞能量范圍為10～30 eV。每個樣品注入ESI源前，需對離子源進行清理，直至背景信號強度小于105的響應，以確保樣品的信號強度大于背景信號的3倍信噪比(S/N)。數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)分析均采用儀器配有的專用軟件進行處理。

1.4 樣品制備

將赤靈芝樣品粉碎后，過24目篩，準確稱取赤靈芝樣品1.0 g，精確至0.000 1 g，加入40 mL 50%甲醇，80 ℃水浴回流1 h，將回流液冷卻至室溫，過濾后獲取濾液。將濾液稀釋(10倍)，過0.22 μm濾膜后質(zhì)譜直接測定。

圖1 不同提取溶劑的赤靈芝質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectra of Ganoderma lucidum with different extract solventsA.pure water;B.50% methanol;C.methanol

圖2 不同離子源下赤靈芝的FTICR-MS質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectra of Ganoderma lucidum with different ion sourcesA:MALDI source,B:ESI source

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以獲取更多的樣品質(zhì)譜信息作為基礎，為建立快速分析鑒定赤靈芝化學成分的方法，本實驗分別對赤靈芝的提取溶劑和離子源進行了優(yōu)化。分別考察了水、50%甲醇、甲醇作為赤靈芝提取溶劑時，樣品的譜圖情況(見圖1)。結(jié)果顯示，以50%甲醇作為提取溶劑時能獲取更多的質(zhì)譜信號。近年來，基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)直接快速鑒定中藥化學成分的方法取得了飛速發(fā)展。為開發(fā)快速檢測中藥化學成分的分析方法，本實驗考察了電離噴霧(ESI)與MALDI兩種電離源對赤靈芝化學成分快速分析的情況，其中，采用MALDI對赤靈芝進行檢測分析時，利用芥子酸作為基質(zhì)。兩種電離源的檢測結(jié)果見圖2。由圖可見，ESI離子源電離模式下獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)除包含MALDI離子源電離模式的質(zhì)譜數(shù)據(jù)之外，還獲得更多其它質(zhì)譜數(shù)據(jù)，因而ESI源電離效果更有利于赤靈芝成分的電離。由于赤靈芝中含有大量的有機酸類成分，因此，選擇負離子檢測模式進行赤靈芝樣品的檢測分析。最終確定利用50%甲醇提取赤靈芝樣品，在ESI源負離子模式下對樣品進行檢測分析，以獲得更多的樣品質(zhì)譜信號。

2.2 ESI/FTICR-MS成分分析方法的評價

2.2.1 精密度與重復性對同一樣品溶液重復注入6次進行質(zhì)譜檢測，使用相對峰值強度的驗證方法[23]以確定儀器的精密度。經(jīng)計算，m/z133.014 35、195.051 34、515.300 99等質(zhì)譜峰的相對峰值強度的RSD均小于3.6%，說明ESI/FTICR-MS具有較好的儀器精密度。

對6個獨立制備的樣品進行質(zhì)譜檢測，使用相對峰值強度的驗證方法[23]，分別計算m/z133.014 35、195.051 34、515.300 99等質(zhì)譜峰的相對峰值強度的RSD，結(jié)果均低于4.8%，說明ESI/FTICR-MS成分分析方法具有較好的重復性。

圖3 赤靈芝的FTICR-MS指紋質(zhì)譜圖Fig.3 FTICR-MS fingerprint of Ganoderma lucidum

2.2.2 穩(wěn)定性與準確性對同一樣品在0、2、4、8、12、24、36、48 h采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行相對峰值強度[23]分析，分別計算峰強度較高的質(zhì)譜峰，如m/z133.014 35、195.051 34、515.300 99等的相對峰值強度的RSD，結(jié)果均小于4.2%。表明樣本在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定，使用ESI/FTICR-MS成分分析方法可行，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。

進一步通過ESI/FTICR-MS檢測原兒茶酸、檸檬酸標準品，獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與理論值的誤差值均小于3×10-6，這表明ESI/FTICR-MS的質(zhì)量準確度可信。因此，本實驗建立的ESI/FTICR-MS方法有效可行。

2.3 赤靈芝主要成分的鑒定

為確保分析結(jié)果的準確性，每次實驗前均在ESI源正離子模式下用三氟乙酸鈉校正液對質(zhì)量軸進行校正。赤靈芝的主要質(zhì)譜峰如圖3所示,表2為赤靈芝主要成分的鑒定結(jié)果。通過采用ESI/FTICR-MS法，將母離子及其碎片離子與相關文獻進行比較，比較的數(shù)據(jù)包括分子式、質(zhì)荷比和碎片離子信息，從而準確識別出主要成分63種，包括1種萜烯醛，3種糖，4種三萜醇，6種有機酸和49種三萜酸類成分。這些數(shù)據(jù)由儀器系統(tǒng)工作站計算推導，誤差值均小于3.0 ×10-6。

表2 赤靈芝成分的鑒定結(jié)果Table 2 Ingredient identification of Ganoderma lucidum

(續(xù)表2)

Peak No.Molecular formulaParent ion(m/z)Error(×10-6)Daughter ions(m/z)Identification27C30H38O7509.256 01-3.0491.243 40,467.316 46,461.196 74,447.253 86,432.230 43,417.206 93,299.165 17Ganoderenic acid F[19]28aC30H40O7511.271 50-2.7478.235 03,431.259 24,301.180 92,261.149 73,247.133 98Ganoderenic acid D[18]28bC30H40O7511.271 50-2.7493.259 32,449.269 61Ganoderic acid F[18]29aC30H40O7513.287 33-3.0451.286 05,436.261 75Ganoderic acid J[18]29bC30H40O7513.287 33-3.0495.275 09,451.285 25,436.261 180Ganoderic acid AM1[18]29cC30H40O7513.287 33-3.0495.275 09,451.285 25Ganoderic acid D[18]29dC30H40O7513.287 33-3.0495.275 09,451.285 25,329.175 70,303.196 55,287.201 61Ganoderenic acid B[29]30aC30H44O7515.300 990.8497.290 74,479.280 22Ganoderic acid A[18]30bC30H44O7515.300 990.8497.290 74,453.300 82,435.291 18Ganoderic acid δ[32]30cC30H44O7515.300 990.8497.290 74,453.300 823,7,15-Trihydroxy-11,23-dioxolanost-8,16-dien-26-oic acid[7]30dC30H44O7515.300 990.8498.294 03,454.304 21,304.199 90,287.165 24Ganoderic acid B[18]31aC30H46O7517.315 912.3499.306 62,481.295 98,455.316 51,437.305 89Ganoderic acid C2[18]31bC30H46O7517.315 912.3302.188 67Ganolucidic acid C[28]32aC30H40O8527.263 822.3509.254 30,465.264 57,317.175 73,301.180 56Elfvingic acid A[18]32bC30H40O8527.263 822.3509.254 30,465.264 57,301.180 5612-Hydroxy-3,7,11,15,23-pentaoxo lanost-8-en-26-oic acid[18]32cC30H40O8527.263 822.3509.254 30,483.274 89,465.264 57,317.175 733,12-Dihydroxy-4,4,14-trimethyl-7,11,15-trioxo-lanost-8,9,20,22-en-26-oic acid[18]33aC30H42O8529.281 60-1.7511.269 85,467.280 1212-Hydroxyganoderic acid D[18]33bC30H42O8529.281 60-1.7511.269 93,493.259 52,301.180 83,263.128 85Ganoderic acid D2[19]33cC30H42O8529.281 60-1.7511.269 93,467.280 10,437.233 19Ganoderic acid C6[18]34C30H44O8531.297 35-1.9513.285 56,469.295 81,454.272 41,436.263 27,301.180 89Ganoderic acid G[32]35aC30H46O8533.311 84-0.3515.289 87,485.291 0312-Hydroxyganoderic C2[19]35bC30H46O8533.311 84-0.3515.301 18,497.290 73,485.290 63,467.280 07,453.300 77,423.290 23,303.160 05,287.165 173,7,12,15-Tetraphydroxy-11,23-dioxolanost-8-en-26-oic acid[19,26]36C30H44O9547.292 77-2.8529.280 48,511.269 89,493.259 34,485.290 60,317.175 583,12,15,20-Tetraphydroxy-7,11,23-trioxolanost-8-en-26-oic acid[19]37C32H43O8555.296 210.2513.287 68,495.274 47Lucidenic acid GS-3[33]38C32H42O9569.277 14-2.7551.264 70,509.252 6812-Acetoxyganoderic acid F[18-19]39aC32H44O9571.292 87-2.8553.280 51,511.269 93,481.222 01Ganoderic acid H[18]39bC32H44O9571.292 87-2.8553.280 51,538.264 16,511.269 93,467.280 16Ganoderenic acid K[18]39cC32H44O9571.292 87-2.8551.264 82,509.254 27,465.264 4612-Acetoxyganoderic acid D[18]40C32H46O9573.306 500.7555.297 07,511.306 28,496.281 91Ganoderic acid K[18]41aC37H41O8613.280 590.2595.267 36,553.281 18,509.294 103-Acetylganoderic acid H[18]41bC37H41O8613.280 590.2595.267 36,553.281 183-Acetylganoderenic acid K[18]

2.4 聚類分析

為了區(qū)分不同產(chǎn)地的赤靈芝，實驗采用統(tǒng)計學方法對16個樣品進行分組。通過“距離”大小以獲悉樣品相似度情況，具體結(jié)果如圖4所示。在95%的置信區(qū)間下，不同產(chǎn)地的樣本均得到很好的區(qū)分，通過數(shù)據(jù)點的分離情況可知16批赤靈芝來源于4個不同的產(chǎn)地。如SD-1和SD-2均來自山東省；JL-1、JL-2、JL-3、JL-4、JL-5來自吉林省。結(jié)果表明，利用FTICR-MS檢測赤靈芝的化學成分并通過聚類分析法有助于鑒別赤靈芝的來源，為評價藥材來源提供了依據(jù)。

圖4 16批赤靈芝樣品的聚類分析結(jié)果Fig.4 Cluster analysis results of 16 Ganoderma lucidum samples

2.5 主成分分析

為了評價赤靈芝樣品的質(zhì)量和來源，采用化學計量主成分分析(PCA)方法，根據(jù)FTICR-MS獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對16批赤靈芝樣品進行分類。在95%的置信區(qū)間下，根據(jù)PCA得分圖和荷載圖對樣品進行區(qū)分，具體結(jié)果如圖5所示。在圖5A中，4個不同來源的數(shù)據(jù)點被清晰分離。結(jié)果表明，安徽和江西的赤靈芝均落在負相關區(qū)域，山東與吉林的赤靈芝處于正相關區(qū)域，因此安徽和江西的赤靈芝樣本相似，且不同于山東與吉林的樣品，這可能是由地理區(qū)域、氣候變化、生態(tài)環(huán)境的綜合影響所致。具體影響得分結(jié)果的化學成分見圖5B，影響得分的因素分別用PC1和PC2表示。由圖5B，根據(jù)各個成分(質(zhì)荷比)的偏離程度，主要影響得分結(jié)果的質(zhì)荷比分別有：m/z133.01(蘋果酸)、128.05(Unkonwn)、191.05(檸檬酸)、515.35(Ganoderic acid A、ganoderic acidδ、3,7,15-trihydroxy-11,23-dioxolanost-8,16-dien-26-oic acid)、513.25(Ganoderic acid J、ganoderic acid AM1、ganoderic acid D、ganoderenic acid B)、531.30(Ganoderic acid G)、613.25(3-Acetylganoderic acid H、3-acetylganoderenic acid K)。這些成分與赤靈芝的質(zhì)量控制呈較強的正相關關系，其中赤靈芝的小分子有機酸m/z133.01、128.05、191.05與PC1密切相關；同樣，m/z513.25、515.35、531.30和613.25是與PC2密切相關的三萜化合物。該結(jié)果指出的小分子有機酸和三萜類化合物與現(xiàn)代醫(yī)學治療疾病的有效化合物相一致。這些化合物之間的相關性在PCA圖中得到了明顯的體現(xiàn)，因此，這些化合物是全面評估赤靈芝質(zhì)量的潛在成分。

圖5 16批赤靈芝樣品的主成分分析結(jié)果Fig.5 Principal component analysis(PCA) of 16 Ganoderma lucidum samplesA.scores plot;B.loading plot

3 結(jié) 論

本研究建立了一種基于FTICR-MS的赤靈芝化學成分快速鑒定和指紋圖譜分析方法，結(jié)合一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與相關文獻的報道共鑒定出赤靈芝中63種化學成分，包括1種萜烯醛、3種糖、4種三萜醇、6種有機酸和49種三萜酸類成分。采用聚類分析、主成分分析等統(tǒng)計學方法對不同產(chǎn)地的赤靈芝樣品進行來源分析，得到了較好的來源區(qū)分結(jié)果。PCA結(jié)果顯示不同產(chǎn)地來源的赤靈芝存在一定的差異性，其差異與有機酸、三萜酸類化合物相關，這些化合物可作為評估赤靈芝質(zhì)量穩(wěn)定性和一致性的標記物。研究結(jié)果表明，F(xiàn)TICR-MS可直接、快速、高效地實現(xiàn)赤靈芝的化學成分鑒定和指紋圖譜研究，在中藥分析和質(zhì)量控制領域有廣闊的應用前景。