布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌引起的一種人獸共患病，感染動(dòng)物表現(xiàn)睪丸炎、不孕、不育、流產(chǎn)等癥狀，人類感染為波浪熱、關(guān)節(jié)炎、脾臟腫大，也可引起生殖系統(tǒng)障礙[1-2]。布病嚴(yán)重影響動(dòng)物生產(chǎn)性能和產(chǎn)品品質(zhì)，對(duì)畜牧業(yè)的生產(chǎn)和健康發(fā)展帶來重大損失。近年來在我國(guó)北方部分地區(qū)、特別是牧區(qū)出現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展和農(nóng)牧民身體健康[3-4]。該病治療效果較差，以預(yù)防為主。故建立快速、準(zhǔn)確診斷方法是控制、凈化布病的必要手段。

目前布病的檢測(cè)方法主要有病原學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)?，F(xiàn)以血清學(xué)方法最為成熟，常用的方法有平板凝集(RBT)、試管凝集(SAT)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)(CFT) 、ELISA等。其中RBT由于操作簡(jiǎn)單，但敏感性、特異性均不高，而廣泛地被用作現(xiàn)場(chǎng)的大規(guī)模初篩性試驗(yàn)；SAT雖然能用于定性檢測(cè)，但主要檢測(cè)血清中的IgM, 由于IgM在血清中存在時(shí)間較短、含量也不如IgG高等原因，導(dǎo)致該方法敏感性、特異性也不高；CFT也能用于定性檢測(cè)，但由于操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)也不常被采用。ELISA由于其快速、操作簡(jiǎn)單，在國(guó)際貿(mào)易中被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定為檢測(cè)布病的指定方法，被公認(rèn)為是一種比較有前途的方法。但是血清學(xué)方法檢測(cè)的是菌體表面的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，布魯氏菌的LPS與傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、小腸耶爾森菌O∶9等存在相似結(jié)構(gòu)，故在診斷中存在假陽(yáng)性[5]。因此，新型診斷抗原的研制是建立ELISA方法的關(guān)鍵。

布魯氏菌表面蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，而且在布魯氏菌各個(gè)種間具有高度的保守性，以表面蛋白作為診斷抗原不容易和其他細(xì)菌，如大腸桿菌、小腸耶爾森菌等發(fā)生交叉反應(yīng)，減少假陽(yáng)性[5-7]。很多表面蛋白，如omp25、 omp28、omp31和bp26都曾被用做診斷抗原研究，但究竟哪個(gè)/些表面蛋白的特異性強(qiáng)、敏感性高，目前仍在探索。

由于噬菌體展示技術(shù)可以構(gòu)建大容量文庫(kù)并具有高通量篩選等特性，本研究利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建布魯氏菌蛋白文庫(kù)，通過差減篩選，選擇具有良好特異性、親和力及反應(yīng)原性的表面蛋白，為確定診斷用抗原奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 TG1大腸桿菌(廣州碧云天生物有限公司)；羊型布魯氏菌16M株(標(biāo)準(zhǔn)熱滅活,本室保存)；輔助噬菌體VCSM13(海軍總醫(yī)院周麗君教授惠贈(zèng))；噬菌粒載體pYW01(梅西大學(xué)Jasna教授惠贈(zèng))。 VCSM13及pYW01經(jīng)測(cè)序鑒定，序列全部正確。

Taq Master Mix、細(xì)菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA Marker(康為世紀(jì)公司)；T4 DNA ligase、末端快速補(bǔ)平試劑盒、SmaI內(nèi)切酶、蝦堿性磷酸化酶(NEB公司)；超聲波細(xì)胞粉碎儀(新芝SCIENTZ-IID型)；電轉(zhuǎn)儀(BIO RAD公司)。噬菌粒載體pYW01引物由長(zhǎng)春庫(kù)美生物科技有限公司合成，上游引物5′- AACATATGAAATACCTGCTGCCGAC-3′，下游引物5′- TCTTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCT-3′。

1.2 噬菌體展示布魯氏菌16M株基因組文庫(kù)構(gòu)建

1.2.1布魯氏菌16M株基因組提取及基因組片段化 以布魯氏菌16M株菌液(經(jīng)熱滅活)為模板，利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取16M株基因組，具體操作按試劑盒進(jìn)行。

將超聲條件設(shè)定為輸出功率40%,每次超聲3 s,間隔6 s,超聲次數(shù)為10下，超聲DNA總體積約500 μL，將基因組DNA隨機(jī)打斷。利用膠回收試劑盒對(duì)線性片段回收，以除去小于200 bp大于3 000 bp的片段。

1.2.2破碎基因組片段末端補(bǔ)平 將細(xì)菌基因組超聲片段進(jìn)行隨機(jī)片段末端平齊化，體系如下：DNA隨機(jī)片段38 μL、T4 DNA polymerase 1 μL、10×T4 DNA polymerase reaction buffer 5 μL、dNTP Mixture 2 μL、H2O 4 μL，11 ℃反應(yīng)20 min,70 ℃滅活10 min。補(bǔ)平后利用膠回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化，準(zhǔn)備連接。

1.2.3酶切質(zhì)粒pYW01及去磷酸化SmaⅠ單酶切噬菌粒載體pYW01，體系如下：10× buffer 5 μL、SmaI 1 μL、pYW01 30 μL，Water 14 μL。25 ℃，反應(yīng)5 h。然后利用蝦堿性磷酸酶(rSAP)直接進(jìn)行去磷酸化，以防止載體自連，即直接在酶切反應(yīng)結(jié)束后的體系中加入rSAP 1.5 μL，37 ℃溫育60 min后65 ℃熱滅活20 min。去磷酸化后膠回收試劑盒進(jìn)行純化，準(zhǔn)備連接。

1.2.4感受態(tài)細(xì)胞制備 取1 mL TG1母液接種到200 mL新鮮的LB培養(yǎng)液中,37 ℃,170 r/min 振蕩培養(yǎng)2.5 h，使OD450達(dá)到0.7左右。冰浴30 min，4 000 r/min，4 ℃離心20 min，棄上清收集菌體。用含有10%甘油的無菌水洗滌菌體2次。最后用400 μL 10%甘油無菌水重懸細(xì)胞沉淀,分裝，每管100 μL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5連接 利用T4 DNA ligase將末端補(bǔ)平的布魯氏菌16M株基因組超聲片段和酶切質(zhì)粒pYW01(去磷酸化)以4∶1比例(摩爾比)進(jìn)行連接，體系如下：DNA隨機(jī)片段12 μL、pYW01 1 μL、T4 DNA ligase 1 μL、10×ligation buffer 2 μL、H2O 4 μL。22 ℃連接1 h 后70 ℃熱滅活5 min。

1.2.6電轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物20 μL電轉(zhuǎn)化至100 μL 感受態(tài)細(xì)胞中。(冰浴條件下，將連接產(chǎn)物和感受態(tài)細(xì)胞用槍頭緩慢混合均勻)電轉(zhuǎn)化條件為：1 mm電擊槽、電壓1 800 V、電阻200 Ω、電容25C，同時(shí)將2 μL 噬菌粒載體pYW01轉(zhuǎn)入100 μL TG1中作為對(duì)照，以檢測(cè)感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。電轉(zhuǎn)完成后立即加入900 μL LB液體培養(yǎng)基,震蕩活化45 min(37 ℃，170 r/min)，此即為噬菌體展示布魯氏菌16M株基因文庫(kù)。

1.3基因文庫(kù)容量計(jì)算及隨機(jī)性檢測(cè) 取上述10 μL連接菌液用LB液體培養(yǎng)基稀釋至100 μL，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(20 μg/mL氯霉素)37 ℃過夜培養(yǎng)。觀察各平板菌落形成數(shù)量，以公式計(jì)算庫(kù)容量(cfu/mL)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

隨機(jī)挑取菌落，LB液體培養(yǎng)基(20 μg/mL氯霉素)搖動(dòng)約6 h，取菌液行PCR，鑒定文庫(kù)插入效率。 PCR體系如下：上、下游引物各0.5 μL，Taq Master Mix 5 μL，菌液1 μL，用水補(bǔ)足體積至10 μL。 Touch-down PCR運(yùn)行程序：94 ℃ 1 min, 94 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s, 72 ℃ 10 min。 其中退火溫度從65 ℃依次降落到50 ℃，溫度每降落一度運(yùn)行兩個(gè)循環(huán)，最后50 ℃運(yùn)行10個(gè)循環(huán)，共計(jì)40個(gè)循環(huán),1%瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.4 噬菌體展示布魯氏菌16M株蛋白文庫(kù)構(gòu)建

1.4.1輔助噬菌體滴度檢測(cè) 10 μL輔助噬菌體VCSM13 用LB液體培養(yǎng)基10倍稀釋，稀釋成10-1～10-1010個(gè)稀釋度。分別取100 μL(10-6、10-8、10-10)稀釋輔助噬菌體和新鮮培養(yǎng)的宿主菌(TG1)100 μL混合均勻后，加入5 mL軟瓊脂混勻后快速倒入已預(yù)熱的LB固體培養(yǎng)基中(20 μg/mL氯霉素)，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h。具體操作按照文獻(xiàn)進(jìn)行[8]，噬菌體滴度(pfu/ mL)=斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.4.3純化噬菌體蛋白文庫(kù) 上述培養(yǎng)物，室溫4 000 r/min 離心10 min；棄上清，用100 mL LB培養(yǎng)基重懸沉淀，加入卡那霉素使其終濃度達(dá)到50 μg/mL，37 ℃培養(yǎng)過夜；次日將菌液 4 000 r/min 離心 20 min，將上清轉(zhuǎn)移至無菌離心管內(nèi)，分別加入1/4 體積的PEG8000- NaCl溶液，劇烈搖晃后，4 ℃過夜放置，沉淀噬菌體；4 ℃，10 000 r/min 離心 30 min；棄上清，用 3 mL PBS 重懸沉淀，即為輔助噬菌體包裝后的展示蛋白文庫(kù)，0.22 μm濾膜過濾除菌即得到純凈的噬菌體懸液。

1.4.4測(cè)序鑒定蛋白文庫(kù) 利用質(zhì)粒小提試劑盒提取此懸液質(zhì)粒DNA，電轉(zhuǎn)化至TG1感受態(tài)細(xì)胞，條件同1.6.2。將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含氯霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取20個(gè)單克隆送公司測(cè)序。將測(cè)序序列與GenBank中16M株序列比對(duì)，鑒定蛋白文庫(kù)。

1.5 差減淘選

1.5.1差減篩選 將噬菌體展示文庫(kù)作為流動(dòng)相,將M5免疫羊血清作為固定相。將免疫血清包被在孔內(nèi)，加入噬菌體展示蛋白文庫(kù)，二者進(jìn)行吸附。以未被吸附的噬菌體展示文庫(kù)作為流動(dòng)相，陽(yáng)性血清作為固定相。提前將陽(yáng)性血清包被在孔內(nèi)，加入免疫血清未吸附的噬菌體展示蛋白文庫(kù)，進(jìn)行淘選。對(duì)差減淘選的噬菌體文庫(kù)進(jìn)行2輪富集。

1.5.2擴(kuò)增陽(yáng)性克隆，測(cè)序 ① 對(duì)淘選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增:挑取每個(gè)單克隆轉(zhuǎn)接至新鮮2×YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。再轉(zhuǎn)接TG1菌液中，培養(yǎng)至OD=0.4左右后，加入輔助噬菌體VCSM13d3(MOI=1∶100)超感染，以擴(kuò)增單個(gè)陽(yáng)性克隆噬菌體文庫(kù)。② 用質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒，操作方法按說明書進(jìn)行。③ 對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行Touch-down PCR鑒定，分析插入片段大小；對(duì)鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒送公司測(cè)序。

1.6噬菌體陽(yáng)性克隆篩選 競(jìng)爭(zhēng)ELISA、Western-blot評(píng)價(jià)陽(yáng)性克隆的親和力、特異性及反應(yīng)原性，篩選具有良好抗原性的噬菌體陽(yáng)性克隆。① 提取LPS，按試劑盒操作進(jìn)行；② 競(jìng)爭(zhēng)ELISA評(píng)價(jià)陽(yáng)性克隆的親和力：以篩選到的噬菌體融合蛋白包被，以提取16M株LPS作為競(jìng)爭(zhēng)相，檢測(cè)陽(yáng)性克隆的親和力；并利用prism軟件分析陽(yáng)性克隆親和力；③ Western-blot評(píng)價(jià)陽(yáng)性克隆的特異性及反應(yīng)原性，DS-PAGE檢測(cè)：取純化后的噬菌體融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時(shí)以輔助噬菌體VCSM13作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)膜：剪下和凝膠大小吻合的6 張3M濾紙和1張PVDF膜(戴手套操作)，PVDF膜先在甲醇溶液中浸泡15 s，轉(zhuǎn)入去離子水中漂洗后，連同3M濾紙轉(zhuǎn)入半干轉(zhuǎn)印緩沖液中，浸泡30 min。將膠用去離子水沖洗后，也放在半干緩沖液中平衡。然后將膠、膜、濾紙制成三明治，注意每一層都不能有氣泡，否則影響轉(zhuǎn)印效果。疊好后，根據(jù)膜的大小，來確定轉(zhuǎn)印時(shí)電流的大小(具體條件的設(shè)定參考儀器說明書)。本試驗(yàn)采用200 mA電流下轉(zhuǎn)印60 min。

免疫檢測(cè)：轉(zhuǎn)印完成后將膜用麗春紅染色，看膠上的目的條帶是否轉(zhuǎn)到膜上；然后用蒸餾水漂洗膜，用10%馬血清封閉1 h后，用PBS洗滌3次，每次5 min；然后用新鮮配置的一抗(陽(yáng)性血清)室溫封閉膜70 min，再用PBST漂洗3次，每次5 min；用新鮮配置的二抗(兔抗羊血清)封閉膜35 min，洗膜3次，操作同上，然后再用PBS洗滌1次，3 min；用DAB染色3～5 min至膜上的條帶清晰后，用蒸餾水終止反應(yīng)。

應(yīng)采取多種營(yíng)銷方式共同發(fā)展,將傳統(tǒng)與新的自媒體營(yíng)銷手段結(jié)合，相互促進(jìn)。武當(dāng)山旅游景區(qū)在建立自媒體平臺(tái)的基礎(chǔ)上更加應(yīng)該注重的是推廣，讓更多人知道景區(qū)官方的微博以及微信公眾號(hào)。還可以通過發(fā)傳單等傳統(tǒng)營(yíng)銷方式推廣一下自媒體營(yíng)銷方式,二者相互作用，合作發(fā)展。

2 結(jié) 果

2.1羊型布魯氏菌16M株基因組提取及超聲破碎結(jié)果 羊型布魯氏菌16M株(標(biāo)準(zhǔn)熱滅活)基因組提取結(jié)果見圖1。從圖中可見DNA提取濃度較高；經(jīng)OD260/280分析，基因組純度也達(dá)到要求。取DNA約500 μL進(jìn)行超聲裂解，結(jié)果見圖1。瓊脂糖凝膠電泳顯示，基因組裂解后隨機(jī)片段大小集中分布在0.3～2 kb之間。

1：Marker從上到下大小依次為100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，1 500 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp，10 000 bp；2：馬爾他布魯氏菌16M株DNA提取結(jié)果；3： Marker；4：基因組DNA超聲裂解結(jié)果圖1 布魯氏菌基因組及超聲破碎電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Result of DNA extraction and cleavage

2.2酶切噬菌粒載體pYW01結(jié)果 提取載體質(zhì)粒pYW01，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶大小與預(yù)期質(zhì)粒大小相符(圖2)。質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序(長(zhǎng)春庫(kù)美生物有限公司)表明，提取結(jié)果正確。經(jīng)SmaI單酶切后，在目的位置發(fā)現(xiàn)單一條帶(圖2)。 對(duì)其進(jìn)行去磷酸化后，準(zhǔn)備連接。

2.3構(gòu)建羊型布魯氏菌16M株全基因組文庫(kù) 取100 μL轉(zhuǎn)化后菌液涂板，經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)后，有菌落在含氯霉素的LB平板上長(zhǎng)出，證明重組噬菌粒載體pYW01成功電轉(zhuǎn)至TG1感受態(tài)細(xì)胞。菌落大小、形態(tài)一致。經(jīng)計(jì)算庫(kù)容量約為108pfu/ mL，達(dá)到建庫(kù)要求。

隨機(jī)挑取17個(gè)單菌落，利用Touch-down RCR程序鑒定插入文庫(kù)的片段，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，插入片段具有較好隨機(jī)性，且插入片段大小分布在0.2～3.0 kb間。

1：Marker從上到下大小依次為100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，1 500 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp，10 000 bp；2：提取噬菌粒pYW01；3：SmaI單酶切噬菌粒pYW01圖2 提取質(zhì)粒pYW01及SmaI單酶切結(jié)果Fig.2 Result of plasmid extraction and SmaI enzyme digestion

1：Marker從上到下大小依次為100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，1 500 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp，10 000 bp；2～18：PCR鑒定結(jié)果圖3 1%瓊脂糖電泳檢測(cè)全基因文庫(kù)中插入片段結(jié)果Fig.3 Insert fragments of the library

2.4構(gòu)建羊型布魯氏菌16M株蛋白文庫(kù) 基因文庫(kù)經(jīng)輔助噬菌體VCSM13感染后，即可包裝成蛋白文庫(kù)。經(jīng)PEG純化后，對(duì)原始蛋白文庫(kù)電轉(zhuǎn)化增殖，37 ℃過夜培養(yǎng)，即為增殖的蛋白文庫(kù)。隨機(jī)挑取LB平板上20個(gè)單克隆送公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與16M株序列比對(duì)，基因同源性達(dá)到98%以上。結(jié)果表明，成功構(gòu)建羊型布魯氏菌16M株表面蛋白文庫(kù)。

2.5差減淘選，擴(kuò)增陽(yáng)性克隆，測(cè)序 利用免疫血清及感染血清對(duì)噬菌體展示蛋白文庫(kù)進(jìn)行差減淘選、兩輪富集后，得到37個(gè)陽(yáng)性克隆。每輪富集結(jié)果見表1。

表1 每輪淘選后陽(yáng)性克隆數(shù)Tab.1 Number of positive clones each round of panning

第一輪(pfu/mL)第二輪(pfu/mL)富集率噬菌體投入量2.0×1072.0×107-洗脫物滴度1.0×1043.0×105300×

對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行Touch-down PCR鑒定，分析插入片段大小；對(duì)鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒送公司測(cè)序。經(jīng)Blast，篩選出6個(gè)噬菌體融合蛋白，結(jié)果見表2。

表2 陽(yáng)性噬菌體融合蛋白Tab.2 Positive phage fusion protein

ACCESSIONlocus_tagproductAE008917BMEI1242hypothetical membrane spanning proteinCP007763DK63_1291hypothetical proteinCP007763DK63_1023outer membrane autotransporter barrel domain proteinCP007763DK63_628glutamate racemaseCP007763DK63_1659outer membrane autotransporter barrel domain proteinAE008918BMEII0036outer membrane protein oprf(an outer membrane porin)

2.6競(jìng)爭(zhēng)ELISA評(píng)價(jià)陽(yáng)性克隆的親和力 以篩選到的噬菌體融合蛋白包被，以提取16M株LPS作為競(jìng)爭(zhēng)相，檢測(cè)陽(yáng)性克隆的親和力，以輔助噬菌體VCSM13d3作為對(duì)照，結(jié)果表明，以融合蛋白BMEI1242、DK63-1291、BMEII0036親和力最強(qiáng)見圖4。且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3個(gè)融合蛋白之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.038 22,P>0.05)。

2.7Western-blot評(píng)價(jià)陽(yáng)性克隆的特異性及反應(yīng)原性 以布魯氏菌病陽(yáng)性血清為一抗，進(jìn)行Western-blot分析各個(gè)陽(yáng)性克隆的特異性及反應(yīng)原性，以VCSM13d3為陰性對(duì)照，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，這6個(gè)噬菌體融合蛋白均具有較好的反應(yīng)原性及特異性，而與輔助噬菌體不發(fā)生發(fā)應(yīng)。

圖4 噬菌體融合蛋白c-ELISA結(jié)果Fig.4 Result of c-ELISA of phage-fusion proteins

1：低分子量蛋白Marker; 2：BMEII0036; 3：DK63_1659; 4：DK63_628; 5：DK_631023; 6：DK63_129; 7：VCSM13d3; 8：BMEI124圖5 感染/陽(yáng)性血清的 Western-Blot 結(jié)果Fig.5 Result of Western-Blot

3 討 論

布魯氏菌病新型診斷抗原的研究主要集中在兩個(gè)方面。LPS作為傳統(tǒng)的診斷抗原，一直不斷被試圖改造[9-12]。LPS含有M和A兩個(gè)表位，其中A表位是引起交叉反應(yīng)的主要原因，而這兩個(gè)表位還不能被分離[13]。因此新合成的LPS只含有M 表位或者含有被改造的A表位。但化學(xué)方法合成的LPS在生物學(xué)活性上，可能會(huì)大大降低。本研究通過利用噬菌粒載體pYW01及輔助噬菌體VCSM13構(gòu)建了噬菌體展示布魯氏菌表面蛋白文庫(kù)，使目的蛋白能與噬菌體的pⅢ蛋白融合，共同展示在噬菌體表面。后續(xù)利用靶分子即可對(duì)文庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，并且該技術(shù)還可以將基因型與表型聯(lián)系起來。因此，噬菌體展示技術(shù)在腫瘤標(biāo)記物的識(shí)別、新型抗毒血清治療、疫苗候選株篩選、藥物開發(fā)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究等方面得到廣泛應(yīng)用[14-17]。本研究所用噬菌體展示系統(tǒng)，是Jasna教授等人于2013年構(gòu)建，該系統(tǒng)能降低外源蛋白對(duì)于宿主菌(大腸桿菌)的毒性，提高展示效率等特性[18]。此系統(tǒng)用于構(gòu)建布魯氏菌表面蛋白文庫(kù)還是首次，為布魯氏菌新型診斷抗原的篩選奠定基礎(chǔ)。

致謝本研究得到梅西大學(xué)Jasna Rakonjac教授，海軍總醫(yī)院周麗君教授的無私幫助。

利益沖突：無

引用本文格式：王闊鵬，于凌嬌，劉倩宏,等.噬菌體展示布魯氏菌蛋白文庫(kù)構(gòu)建及差減篩選融合蛋白[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(5):376-381.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.056