布魯氏菌病是由布魯氏菌(Brucellaspp.)屬引起的人獸共患性傳染病，嚴(yán)重威脅著人和多種動(dòng)物的生命健康。我國(guó)將布魯氏菌病列為二類傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為B類法定傳染病[1]。布魯氏菌病呈世界性流行，可引發(fā)多種家畜的流產(chǎn)、不育以及人的波浪熱，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和食品安全問(wèn)題[2-4]。在我國(guó)31個(gè)省、市、自治區(qū)都有不同程度的發(fā)生和流行，在全世界170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)存在和流行，而在拉丁美洲它每年造成約6億美元的損失，在美國(guó)每年造成的損失平均達(dá)1.5億美元[4]。隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，布魯氏菌病在多數(shù)疫區(qū)有明顯回升的趨勢(shì)。

布魯氏菌細(xì)胞膜是一個(gè)3層膜的結(jié)構(gòu)，OMP25與OMP31均為OmpA家族成員之一，是布魯氏菌的重要外膜蛋白，在維持細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、細(xì)菌毒力等方面發(fā)揮著重要作用[6-9]。目前布魯氏菌病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括免疫學(xué)檢測(cè)方法(包括凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、變態(tài)反應(yīng)檢查、ELISA檢測(cè)方法等)、病原學(xué)檢查與分子生物學(xué)技術(shù)(包括PCR檢測(cè)方法、脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)、熒光偏振試驗(yàn)等)等方法[10-11]。

在國(guó)際貿(mào)易中，布魯氏菌病ELISA檢測(cè)方法被指定為牛種布魯氏菌病的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法；而我國(guó)布魯氏菌病法定檢測(cè)方法中，血清學(xué)診斷方法存在非特異性反應(yīng)、假陽(yáng)性、前帶現(xiàn)象或動(dòng)物自身免疫抑制等缺陷，遠(yuǎn)不能滿足對(duì)布魯氏菌病的防控需求。因此，本研究在克隆表達(dá)豬種布魯氏菌S2株OMP25與OMP31外膜蛋白的基礎(chǔ)上，建立了羊布魯氏菌病ELISA檢測(cè)方法，從而為羊布魯氏菌病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌種與質(zhì)粒 豬種布魯氏菌S2株(Brucellasuis)由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21表達(dá)菌(DE3)與pET-28a原核表達(dá)載體由山東綠都生物科技有限公司重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑NdeⅠ與EcolⅠ限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體、rTaq Mix、T4連接酶、DL2000 Marker與IPTG購(gòu)自大連寶生物制品有限公司；羊布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性與陰性血清、布魯氏菌虎紅平板凝集抗原購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的金黃色葡萄球菌蛋白A (HRP-SPA)購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；可溶型單組分TMB底物溶液購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；His-Tag親和層析試劑盒購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)布魯氏菌S2株OMP25與OMP31基因組序列，設(shè)計(jì)引物，并引入NdeⅠ與EcolⅠ酶切位點(diǎn)，分別擴(kuò)增573 bp與783 bp的目的基因片段。將引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

OMP25和OMP31的引物序列如下：

OMP25基因上游引物：5′-TATCATATGATGCGCACTCTTAAGTCTCT-3′

OMP25基因下游引物：5′ -GTGAATTCTTAGAACTTGTAGCCGATGC-3′

OMP31基因上游引物：5′-TATCATATGGCCGACATCATCGTTGT-3′

OMP31基因下游引物：5′-GGTGAATTCTTAGAGCTTGTAGTTCAG-3′

1.2.2OMP25與OMP31目的基因的擴(kuò)增 將布魯氏菌S2株放入80 ℃水浴鍋中30 min進(jìn)行滅活，應(yīng)用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組。以提取的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為： rTaq mix 10 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 4 μL，H2O 4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，57 ℃/60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃ 終止反應(yīng)。OMP25與OMP31目的片段分別為573 bp與783 bp。

1.2.3OMP25與OMP31原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，利用膠回收試劑盒回收純化DNA，用NdeⅠ與EcolⅠ限制性內(nèi)切酶同時(shí)對(duì)目的基因片段和pET-28a原核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切并回收純化，T4 DNA連接酶16 ℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pET-OMP25與pET-OMP31，經(jīng)NdeⅠ與EcolⅠ雙酶切鑒定正確后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.4OMP25與OMP31目的蛋白的表達(dá) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-OMP25與pET-OMP31轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌，并加入IPTG 37 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)16 h后，進(jìn)行超聲裂解后，收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.2.5OMP25與OMP31目的蛋白的純化與鑒定 采用親和層析法，將表達(dá)的OMP25與OMP31蛋白進(jìn)行分離純化，應(yīng)用BCA法分別測(cè)定兩種蛋白的濃度，并應(yīng)用Western blot技術(shù)，確定純化蛋白的抗原性和特異性，將純化并鑒定正確的OMP25與OMP31蛋白分別進(jìn)行凍干保存。

1.2.6羊布魯氏菌病抗體PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒反應(yīng)條件的確定

1.2.6.1OMP25與OMP31蛋白最佳配比的確定 將凍干保存的OMP25與OMP31蛋白溶解至凍干前的體積，將OMP25與OMP31蛋白分別按1∶1、2∶1、3∶1與4∶1的配比加入96孔ELISA板中，100 μL /孔(混合蛋白濃度10 μg/mL)，4 ℃孵育16 h；應(yīng)用羊布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇OMP25與OMP31蛋白的最佳配比濃度。

1.2.6.2OMP25與OMP31混合蛋白最佳包被濃度的確定 將純化的OMP25與OMP31混合抗原進(jìn)行20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL 稀釋并包被96孔板，應(yīng)用布魯氏菌病陽(yáng)性與陰性標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清OD450≈1.0，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清OD450<0.2時(shí)，確定該蛋白濃度為最佳包被濃度。

1.2.6.3OMP25與OMP31蛋白最佳包被時(shí)間和溫度的確定 將OMP25與OMP31混合蛋白加入96孔ELISA板中，分別在4 ℃ 12 h、4 ℃ 16 h、4 ℃ 20 h、4 ℃ 24 h、37 ℃ 2 h、37 ℃ 3 h、37 ℃ 4 h進(jìn)行包被，經(jīng)ELISA檢測(cè)，選取P/N值最大的組，確定最佳包被時(shí)間。

1.2.6.4血清最佳稀釋倍數(shù)的確定 將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800共6個(gè)稀釋度進(jìn)行方陣滴定試驗(yàn)，將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清OD450≈1.0，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清OD450<0.2，選取P/N值最大的組合，確定為待檢血清的稀釋倍數(shù)。

1.2.6.5陰陽(yáng)性臨界值的確定 應(yīng)用已優(yōu)化的最佳ELISA反應(yīng)條件，對(duì)40份羊布魯氏菌病陰性血清進(jìn)行ELISA測(cè)定，并計(jì)算其平均值(X)及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理確定陰陽(yáng)性臨界值：樣本的OD450值> OD450(-)平均值+3×S時(shí)，可以在99.9%的水平上判為陽(yáng)性，則設(shè)定陰陽(yáng)性臨界值=OD450(-)平均值+3×S。

1.2.6.6PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒特異性試驗(yàn) 應(yīng)用以上組裝的羊布魯氏菌病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒，分別對(duì)大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門(mén)氏菌、羊布魯氏菌陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，確定其特異性。

1.2.6.7PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒敏感性試驗(yàn) 將羊布魯氏菌病陽(yáng)性血清分別進(jìn)行1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800倍稀釋，應(yīng)用已有的ELISA試劑盒按以上最佳條件進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)檢測(cè)為陽(yáng)性的血清的最大稀釋倍數(shù)，確定該試劑盒敏感性的高低。

1.2.6.8羊布魯氏菌病抗體PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn):4人分別應(yīng)用同1批次羊布魯氏菌病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒，對(duì)10份羊布魯氏菌病陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各值之間的變異系數(shù);批間重復(fù)性試驗(yàn):取4批次羊布魯氏菌病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒，分別對(duì)10份羊布魯氏菌病陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各值之間的變異系數(shù)。

1.2.6.9PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒與布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)對(duì)比性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)來(lái)自于山東省部分地區(qū)的、布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性的63份血清與檢測(cè)為陰性的80份血清，分別應(yīng)用研發(fā)的羊布魯氏菌病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算該試劑盒的符合率。

2 結(jié) 果

2.1OMP25與OMP31基因片段的PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank公布的布魯氏菌S2株OMP25與OMP31基因組序列，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示分別獲得了573 bp與783 bp的目的基因片段。

A：PCR of OMP25; B：PCR of OMP31圖1 OMP25與OMP31基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR of OMP25 and OMP31

2.2OMP25與OMP31原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-OMP25與pET-OMP31質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切鑒定與測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ與EcolⅠ雙酶切鑒定，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)約573 bp與783 bp大小的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致；測(cè)序結(jié)果表明OMP25與OMP31基因序列與GenBank公布的序列100%相同；以上結(jié)果說(shuō)明pET-OMP25與pET-OMP31重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A: NdeⅠ/EcolⅠ雙酶切pET-OMP25重組質(zhì)粒B: NdeⅠ/EcolⅠ雙酶切pET-OMP31重組質(zhì)粒圖2 pET-OMP25質(zhì)粒與pET-OMP31質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombination plasmid pET-OMP25 and pET-OMP31 by digesting with restriction enzymes

2.3OMP25與OMP31目的蛋白的表達(dá)與可溶性鑒定 將pET-OMP25與pET-OMP31進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明，分別在約25 Ku與31 Ku位置出現(xiàn)一條濃染蛋白條帶(圖3)，而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和經(jīng)誘導(dǎo)的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)提取物沒(méi)有相應(yīng)目的條帶。離心收集菌液，超聲破碎后，離心分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，表明OMP25與OMP31基因均以包涵體形式進(jìn)行了有效表達(dá)(圖4)。

A：1，OMP25誘導(dǎo)前；2，在 37 ℃下IPTG誘導(dǎo)OMP25表達(dá)B：1，OMP31誘導(dǎo)前；2，在 37 ℃下IPTG誘導(dǎo)OMP31表達(dá)M：蛋白分子量Marker圖3 OMP25與OMP31目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed OMP25 and OMP31

A：1，OMP25蛋白在上清中表達(dá)情況；2，OMP25蛋白在沉淀中表達(dá)情況A：1，OMP31蛋白在上清中表達(dá)情況；2，OMP31蛋白在沉淀中表達(dá)情況M：蛋白分子量Marker圖4 OMP25與OMP31目的蛋白在上清與沉淀中的表達(dá)Fig.4 Expression of OMP25 and OMP31protein in upper clearing and precipitation

2.4OMP25與OMP31目的蛋白的純化與鑒定 采用親和層析法，將OMP25與OMP31目的蛋白純化后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，最終分別只有一條目的條帶，表明OMP25與OMP31目的蛋白獲得了純化(圖5)。將純化的OMP25與OMP31蛋白分別進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明，OMP25與OMP31蛋白均能與羊布魯氏菌多克隆抗體相反應(yīng)，經(jīng)DAB顯色后分別在25 Ku與31 Ku左右有一明顯特異性條帶，表明OMP25與OMP31蛋白具有良好的免疫學(xué)活性(圖6)。

A:1,OMP25蛋白用500 mmol/L咪唑洗脫結(jié)果；2,OMP25蛋白用200 mmmol/L咪唑洗脫結(jié)果A:1,OMP31蛋白用500 mmol/L咪唑洗脫結(jié)果；2,OMP31蛋白用200 mmmol/L咪唑洗脫結(jié)果M：蛋白分子量Marker圖5 OMP25與OMP31目的蛋白的純化Fig.5 Purification of OMP25 and OMP31 target proteins

A：OMP25蛋白免疫印跡分析；B：OMP31蛋白免疫印跡分析；M：蛋白分子量Marker圖6 OMP25與OMP31目的蛋白Western blotting鑒定Fig.6 Western Blot analysis of OMP25 and OMP31 proteins expression

2.5羊布魯氏菌病PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒最佳反應(yīng)條件的確定 經(jīng)以上ELISA檢測(cè)確定，OMP25與OMP31蛋白的最佳配比濃度為4∶1；混合蛋白的最佳包被濃度為10 μg/mL；最佳包被時(shí)間與溫度分別為37 ℃ 1 h；血清的最佳稀釋倍數(shù)為1∶50倍稀釋；血清最佳孵育時(shí)間37 ℃ 1 h；酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為1∶2 000倍稀釋，最佳孵育時(shí)間為37 ℃ 1 h；底物最佳顯色時(shí)間為37 ℃ 15 min。

2.6陰陽(yáng)性臨界值的確定 應(yīng)用已優(yōu)化的最佳ELISA反應(yīng)條件，對(duì)40份羊布魯氏菌病陰性血清進(jìn)行ELISA測(cè)定。經(jīng)測(cè)定，其平均值X為0.208，標(biāo)準(zhǔn)差為0.053，即當(dāng)樣本OD450nm值≥0.367時(shí)判為陽(yáng)性，當(dāng)樣本OD450nm值≤0.314時(shí)判為陰性，OD450值處于兩者之間判為可疑。

2.7PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒特異性試驗(yàn) 應(yīng)用以上組裝的羊布魯氏菌病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒，分別對(duì)大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門(mén)氏菌、羊布魯氏菌陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，應(yīng)用該試劑盒，大腸桿菌、巴氏桿菌與沙門(mén)氏菌病陽(yáng)性血清均為布魯氏菌陰性，而羊布魯氏菌陽(yáng)性血清其OD450nm值為1.051，為強(qiáng)陽(yáng)性。該結(jié)果說(shuō)明，本試劑盒具有較好的特異性(見(jiàn)表1)。

表1 羊布魯氏菌病抗體PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒特異性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of PPA-ELISA test kit specificity test for antibody against sheep brucellosis

常見(jiàn)病陽(yáng)性血清布魯氏菌陽(yáng)性/陰性血清大腸桿菌巴氏桿菌沙門(mén)氏菌Positive controlNegative controlOD4500.2190.1280.0771.0120.055S/P---1.00

2.8羊布魯氏菌病抗體PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒敏感性試驗(yàn) 將羊布魯氏菌病陽(yáng)性血清分別進(jìn)行系列稀釋后，應(yīng)用ELISA試劑盒，按以上最佳條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，羊布魯氏菌病陽(yáng)性血清稀釋度為1∶6 400時(shí)，其OD450nm值處于臨界狀態(tài)(P/N值為0.335)，表明該試劑盒具有較強(qiáng)的敏感性(圖7)。

圖7 PPA-ELISA試劑盒敏感性試驗(yàn)Fig.7 Sensitivity test of PPA-ELISA kit

2.9羊布魯氏菌病抗體PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒重復(fù)性試驗(yàn) 經(jīng)檢測(cè)，結(jié)果顯示，該羊布魯氏菌病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)為0.42%～1.85%，均小于5 %(見(jiàn)表2)；批間變異系數(shù)為0.48%～7.65%，均小于10%(見(jiàn)表3)；說(shuō)明該試劑盒具有良好的重復(fù)性。

表2 羊布魯氏菌病抗體PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of PPA-ELISA test kit in-batch repeatability test for antibody against Sheep Brucellosis

樣品重復(fù)次數(shù)( S/P )平均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)12345678xSCV/%10.7860.7950.7740.7690.7520.7710.7820.7940.7780.0141.79920.8570.8660.8410.8610.8540.8500.8640.8690.8580.0091.04930.6590.6730.6420.6510.6630.6600.6490.6680.6580.0101.52040.7150.7060.7130.7150.7210.7140.7090.7110.7130.0050.70150.7390.7290.7310.7300.7350.7340.730.7350.7330.0030.40960.5990.5870.5890.5950.5940.5980.5910.5900.5930.0040.67570.6790.6780.6880.6750.6810.6900.6860.6790.6820.0050.73380.5770.5720.5690.5810.5670.5710.5730.5690.5720.0050.87490.5990.5970.5910.5930.5890.5970.5940.5920.5940.0030.505100.7290.7320.7350.7280.7290.7310.7360.7280.7310.0030.410

表3 羊布魯氏菌病抗體PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of PPA-ELISA test kit of repeated test between batches of antibody against sheep brucellosis

檢測(cè)樣品不同批次(S/P)1234平均值x標(biāo)準(zhǔn)差S變異系數(shù)CV/%10.8080.7920.8370.8360.8180.0222.68920.7140.7390.6980.7420.7230.0212.90530.4550.4380.4250.4520.4430.0143.16040.5120.5010.5320.5120.5140.0132.52950.6080.6250.6050.6180.6140.0091.46660.1520.1760.1630.1490.1600.0127.50070.0850.0810.080.0810.0820.0022.43980.8540.8490.8550.8590.8540.0040.46890.7890.7680.7740.7630.7740.0111.421100.5150.5360.5280.5340.5280.0091.705

2.10羊布魯氏菌病抗體PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒與布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)對(duì)比性試驗(yàn) 對(duì)來(lái)自山東省部分地區(qū)的、布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性的63份血清與檢測(cè)為陰性的80份血清，分別應(yīng)用本研究的羊布魯氏菌病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，63份陽(yáng)性血清中，ELISA檢測(cè)陽(yáng)性為60份，陰性為3份；80份陰性血清張，ELISA檢測(cè)陽(yáng)性為10份，陰性為70份。因此，羊布魯氏菌病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒相對(duì)于布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)的符合率為91.4%，敏感性為95.2%，特異性為87.5%(見(jiàn)表4)。

表4 羊布魯氏菌病抗體PPA-ELISA檢測(cè)試劑盒與虎紅平板凝集試驗(yàn)對(duì)比性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Comparison between PPA-ELISA test kit and tabular agglutination test results

虎紅平板凝集試驗(yàn)符合率/%敏感性/%特異性/%陽(yáng)性陰性酶聯(lián)免疫陽(yáng)性601091.495.287.5吸附試驗(yàn)陰性370

3 討 論

傳統(tǒng)的布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)方法包括虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等，與ELISA檢測(cè)方法相比，以上方法具有敏感性低，易與大腸桿菌、耶爾森氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)等缺點(diǎn)。因此，新制定的中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18646-2018)將ELISA方法列為了動(dòng)物布魯氏菌病的標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)。另一方面，葡萄球菌A蛋白(SPA)可與多種動(dòng)物血清IgG Fc片段結(jié)合，因此，將其與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)形成酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白(PPA)作為酶標(biāo)第二抗體，則具有應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，可做為豬、牛等其它動(dòng)物布病抗體檢測(cè)的輔助手段。因此，本研究以豬種布魯氏菌S2株OMP25與OMP31外膜蛋白為抗原，以PPA為二抗建立了羊布魯氏菌病間接ELISA檢測(cè)方法，從而為羊布魯氏菌病的防控提供參考。OMP25與OMP31均屬于布魯氏菌的第三組外膜蛋白，在維持細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要作用，與布魯氏菌的毒力、胞內(nèi)生產(chǎn)機(jī)制密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌OMP25蛋白還是一種重要的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，可抑制宿主細(xì)胞分泌TNF-a，從而使布魯氏菌可以在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存活。OMP31蛋白位于布魯氏菌菌體表面，在不同感染動(dòng)物的血清中均能檢測(cè)到該蛋白的抗體。本課題應(yīng)用Western blotting檢測(cè)方法，對(duì)不同動(dòng)物來(lái)源、不同種屬的布魯氏菌陽(yáng)性抗體進(jìn)行了敏感性與特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示，雖然OMP25與OMP31基因高度保守，但其對(duì)不同種屬的布魯氏菌陽(yáng)性血清敏感性與特異性有很大差異。為了提高ELISA檢測(cè)方法的敏感性、擴(kuò)大該方法的檢測(cè)范圍，本研究在表達(dá)純化了OMP25與OMP31重組蛋白的基礎(chǔ)上，將OMP25與OMP31蛋白以不同比例包被96孔聚苯乙烯微孔板，建立了間接ELISA診斷試劑盒，對(duì)試劑盒指控標(biāo)準(zhǔn)及保存期等進(jìn)行了檢驗(yàn)。研究結(jié)果表明，建立的ELISA及組裝的試劑盒具有良好的敏感性和特異性，無(wú)血清交叉反應(yīng)，操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性強(qiáng)，便于保存和運(yùn)輸，可用于臨床布魯氏菌病的檢測(cè)及疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：王海麗，董炳梅，李芬,等.布魯氏菌OMP25與OMP31蛋白的表達(dá)及其間接ELISA診斷試劑盒研制[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(5):404-410.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.050