布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)，是由布魯氏菌屬(Brucella，簡稱布氏菌)的細菌侵犯機體后引起的傳染-變態(tài)反應性的人獸共患傳染病。布氏菌主要存在于牛、羊、豬等家畜和野生動物中，人直接或間接接觸被感染的動物及其制品后可被感染，若治療不及時易轉為難以治愈的慢性病人。布病遍及世界約170個國家和地區(qū)，已成為全球特別是發(fā)展中國家所面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一[1]，我國每個省區(qū)的人畜中幾乎都有不同程度的存在和流行[2]，嚴重危害人類健康、危及食品安全和阻礙畜牧業(yè)經濟發(fā)展。20世紀90年代中期以來，我國布病疫情明顯回升，尤其是2000年以后，布病疫情強勢走高，報告發(fā)病例數平均每年增長10%[3]，近幾年，福建省布病病例報告數增加，發(fā)病率呈逐年增高趨勢，聚集性疫情時有發(fā)生[4]。本文分析2008-2017年福建省人間布病流行特征，并對布氏菌分離株進行基因分型，探討菌株間內在聯系，通過對布氏菌分離株進行分子流行病學研究，為制定布病預防控制策略提供科學依據。

1 材料與方法

1.1資料來源 2008-2017年人間布病疫情資料來自《中國疾病預防控制信息系統(tǒng)》中布病報告卡(已審核卡和臨床與實驗室診斷病例)；人口資料來自《中國疾病預防控制信息系統(tǒng)》福建省常住人口。

1.2菌株來源 40株疑似布氏菌分離自福建省2012-2018年期間布病現癥病人血液標本，布氏菌標準參考菌株羊種(16M)、豬種(1330)和牛種(544)與疫苗菌株S2和M5均由本實驗室保存。

1.3儀器與試劑 主要儀器有LabChip GX II Touch生物大分子分析儀(PerkinElmer公司)、DNA 5K/RNA/CZE LabChip芯片、CLASS II TYPEA2生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、梯度PCR儀、冷凍高速離心機、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等；主要試劑有布氏菌培養(yǎng)基(BD產品)、細菌基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN產品)、EasyTaq PCR SuperMix(全式金產品)、HT DNA 5K Reagent Kit試劑盒、DL2000 DNA marker(Takara產品)等，所用試劑均在保質期內。引物合成與測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4傳統(tǒng)生物學鑒定 根據菌落染色、形態(tài)、生長特性和布氏菌診斷血清凝集試驗確定布氏菌，利用單項特異性A/M血清凝集試驗(玻片凝集試驗)、H2S產生試驗、CO2需求、雙層瓊脂法噬菌體(TB和BK2)裂解(RTD)試驗、染料硫堇/堿性復紅抑菌試驗等進行種/型鑒定，具體操作步驟參照文獻[5]進行。

1.5菌株DNA制備 將分離菌株轉種于布氏菌斜面培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取適量對數生長期的布氏菌菌苔于300 μL無菌去離子水中混勻，80 ℃ 2 h滅活細菌后，按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取DNA， -20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6BCSP31-PCR和AMOS-PCR 根據BCSP31核苷酸序列設計的引物可以對布氏菌進行屬的鑒定；AMOS-PCR可鑒定牛種布氏菌(1、2、4型)，羊種布氏菌(1、2、3型)，豬種布氏菌(1型)以及綿羊附睪種布氏菌。引物序列、擴增體系及反應條件參考文獻[5-7]進行。

1.7MLVA-16(16位點可變數目串聯重復序列分析) 這是一個基于PCR技術的分型方法，該方法通過區(qū)分基因組上多個具有多態(tài)性串聯重復序列位點 (VNTR)的重復單元拷貝數的差異來區(qū)分菌株。16 個位點的16對引物分為2組：panel 1包括8個位點(Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce 42、Bruce43、Bruce45和Bruce55), panel 2包括panel 2A的3個位點(Bruce18、Bruce19和Bruce21)和panel 2B的5個位點(Bruce04、Bruce07、Bruce09、Bruce16和 Bruce30)。引物序列、擴增體系及反應條件均參考文獻[8-10]進行，每次擴增均以16M參考菌株作陽性對照。PCR產物嚴格按照LabChip GX II Touch生物大分子分析儀、DNA 5K/RNA/CZE LabChip芯片和HT DNA 5K Reagent Kit試劑盒操作步驟和使用說明來分析確定各位點擴增產物的大小[11]，同時結合測序結果，計算檢測位點中各VNTR的重復單元數，將16個位點串聯重復數值輸入到 http://mlva.u-psud.fr/，與數據庫進行比較，確定該菌株基因型別。獲得所有菌株的重復序列個數后，利用BioNumerics 6.6軟件對16個位點進行聚類分析。同時選取已發(fā)表文獻中其他省份的布氏菌株的MLVA-16結果進行比較。

1.8統(tǒng)計方法 使用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件，結合描述性流行病學方法進行分析，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。根據PCR產物大小換算各位點重復單元數，結果錄入 Excel數據庫中，利用BioNumerics6.6軟件進行聚類分析，選擇平均連鎖聚類法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA),將獲得的分型與布氏菌數據庫在線比較。

2 結 果

2.1疫情概況 福建省2008-2017年共報告布病416例，無死亡；年均報告發(fā)病率0.11/10萬，發(fā)病率總體呈逐年上升趨勢(趨勢χ2=256.92，P<0.01)，圖1。

圖1 福建省2008-2017年人間布魯氏菌病發(fā)病情況Fig.1 Annual incidences of brucellosis in Fujian Province during 2008-2017

2.1.1地區(qū)分布 福建省各設區(qū)市均有病例報告，總體呈散發(fā)態(tài)勢。漳州(128例)、泉州(68例)和南平(67例)發(fā)病數居前3位，占病例報告總數的63.2%；報告發(fā)病率居前的設區(qū)市依次為漳州(0.26/10萬)、南平(0.25/10萬)和寧德(0.11/10萬)，莆田最低(0.03/10萬)。疫情累計波及全省70個縣區(qū)(80%)，各年發(fā)病縣區(qū)數分別為3、3、4、12、14、18、21、36、28和40個，呈增加趨勢(趨勢χ2=103.72，P<0.01)；以縣(區(qū))為單位，發(fā)病數前5位依次為邵武市(51例)、龍海市(44例)、南安市(27例)、薌城區(qū)(24例)和平和縣(21例)，合計占全省病例的40.1%，報告發(fā)病率以邵武市最高(1.85/10萬)，其次為龍文區(qū)(0.68/10萬)和龍海市(0.48/10萬)。

2.1.2時間分布 人間布病全年均有發(fā)生，發(fā)病高峰為4-8月，報告發(fā)病數為228例，占全年發(fā)病數的54.8%；發(fā)病數較多的月份為5月(55例，13.2%)、4月(46例，11.1%)，其次為6月和8月，均為44例，占比均為10.6%。冬季發(fā)病較少，其中11月份報告發(fā)病數較低，為17例。

2.1.3人群分布 416例病例中，男297例，女119例，發(fā)病率男女性別比為2.50∶1，分別為 0.15/10萬和0.06/10萬，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=67.50，P<0.01)。發(fā)病年齡7個月至79歲，40～64歲合計占62.7%，其中發(fā)病數以45～49歲組最多66例(15.9%)，發(fā)病率以60～64歲組最高 (0.27/10萬)。職業(yè)以農民(174例)、家務及待業(yè)(46例)和牧民(37例)為主，占比61.8%，其中農牧民為50.7%；商業(yè)服務、離退人員、工人等其他職業(yè)占比38.2%，其中學生和散居兒童為4.8%，職業(yè)不詳和其他為21.2%。

2.2傳統(tǒng)生物學鑒定 40株疑似布氏菌分離株在普通大氣下即可生長，呈現圓形、濕潤、稍隆起、表面光滑、無色透明的菌落形態(tài)和無色、透明、濕潤的菌苔特點；布氏菌診斷血清凝集試驗均為陽性；所有試驗結果判定參照FAO/WHO布病專家委員會第6次公報公布的布氏菌屬分類表(1985年)，分別鑒定為5株豬種3型布氏菌和35株羊種3型布氏菌，羊種菌占比87.5%。

2.3BCSP31-PCR鑒定 提取40株疑似布氏菌分離株、3株標準菌株和2株疫苗菌株核酸，用標準菌株和疫苗菌株作陽性對照，無菌水作陰性對照，進行BCSP31-PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測結果顯示，所有布氏菌分離菌株和參考菌株均出現擴增目的片段長度為223 bp的特異性條帶，擴增獲得了預期片段，判定為布氏菌，而陰性對照未出現條帶，圖2。

M:DL2000 DNA Marker; 1～5：陽性對照，分別為羊種16M，牛種544，豬種1330，疫苗菌株S2和M5; 6：陰性對照; 7～46:為分離菌株圖2 福建省布魯氏菌分離株BCSP31-PCR鑒定結果Fig.2 BCSP31-PCR identification for Brucella isolates from Fujian Province

2.4AMOS-PCR鑒定結果 AMOS-PCR對40株布氏菌分離株，3株標準菌株和2株疫苗菌株核酸進行擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測結果顯示，所有陽性對照均出現特異性條帶，擴增獲得了預期片段，分別為羊種(16M和M5)731 bp、牛種(544)498 bp和豬種(1330和S2)285 bp，陰性對照未見擴增；布氏菌分離株中35株均擴增獲得731 bp特異性條帶，與羊種布氏菌(1、2、3型)擴增結果一致，判定為羊種布氏菌；其余5株布氏菌分離株均未出現條帶，豬3型布氏菌未能鑒別出，圖3。

M:DL2000 DNA Marker; 1～5：陽性對照，分別為羊種16M，牛種544，豬種1330，疫苗菌株S2和M5; 6：陰性對照; 7～46:為分離菌株圖3 福建省布魯氏菌分離株AMOS-PCR鑒定結果Fig.3 AMOS-PCR identification for Brucella isolates from Fujian Province

2.5MLVA-16分型 40株布氏菌分離株來自福建省9個設區(qū)市中的8個。所有分離株聚類成羊種菌(35株)和豬種菌(5株)2個種群，豬種菌均來自漳州地區(qū)。

panel 1用于確定布氏菌的種和地理信息。其結果顯示，35株羊種菌分屬于3種基因型：42型(1-5-3-13-2-2-3-2)29株(82.9%)，43型(1-5-3-13-3-2-3-2)4株，63型(1-5-3-13-2-3-3-2)2株，三種基因型均屬于“東地中海型”(East Mediterranean group)；panel 2A結果顯示均為基因41型(4-20-8)。5株豬種菌 panel 1顯示均為基因4型(2-3-4-11-3-1-5-2)，panel 2A顯示均為基因15型(4-19-9)。panel 2B則顯示了較高的變異性。

綜合16個位點擴增結果，MLVA-16顯示40株布氏菌包含32種基因型，羊種菌、豬種菌分別含有28種和4種基因型，其中26種基因型為單分離株，6種基因型為共享基因型，分別由2-4株布氏菌分離株共享(共14株，35.0%)。6種共享基因型中01基因型(4株)分離自漳州和廈門，03基因型(2株)分離自三明和廈門，其他05(2株)、15(2株)、26(2株)和31(2株)共享基因型均分離自同一地區(qū)，其中漳州地區(qū)分離的羊種菌和豬種菌中均有共享基因型，圖4。

同國內已發(fā)表文獻[9-10,12]中的147株布氏菌(羊種菌105株、豬種菌26株和牛種菌16株)MLVA-16分型結果進行聚類分析，福建省5株羊種菌與外省菌株存在4種共享基因型，其中3株與內蒙古地區(qū)羊種菌共享3種基因型，2株與廣東羊種菌共享1種基因型。其他部分菌株與外省菌株存在著較近的遺傳距離，主要表現在panel 2B有1-3個位點的差異，圖5。

3 討 論

目前，我國布病疫情正處于歷史上較為嚴重的時期，布病病例主要集中在北方地區(qū)，南方地區(qū)以散發(fā)病例為主，但暴發(fā)疫情仍時有發(fā)生[4,13]。福建省近幾年畜牧業(yè)快速發(fā)展，從省外引進家畜較多，地區(qū)間牲畜及其制品交易和流通日益頻繁，由于檢疫監(jiān)管制度不健全和布病動物撲殺制度難以執(zhí)行，導致檢疫無保障，許多未經檢疫和患病的牲畜及其制品頻繁流通于市場中，加之群眾缺乏布病防治知識，為布病的輸入和疫情高發(fā)埋下了隱患。自2008年起，福建省布病流行強度呈逐年增高態(tài)勢，疫情從局部高發(fā)地區(qū)逐漸向相鄰低發(fā)或無疫情地區(qū)快速擴散，累計波及全省70個縣區(qū)，病例呈逐年增加趨勢，并由職業(yè)人群向一般人群蔓延。福建省布病發(fā)病呈高度散發(fā)狀態(tài)的同時又呈現一定地域性，多分布于漳州和南平地區(qū)，可能與其羊、豬等家畜飼養(yǎng)及其制品加工業(yè)較發(fā)達有關。因此，重點控制布病疫情高發(fā)區(qū)的同時，也要做好相鄰低發(fā)區(qū)的布病防控，必要時應嚴格限制活畜從高風險地區(qū)向低風險地區(qū)流動，防止疫情的快速蔓延與擴散。

圖4 福建省布魯氏菌分離株MLVA-16聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram based on the MLVA-16 genotyping assay(UPGMA method), showing relationships of the 40 Brucella isolates from Fujian Province

圖5 福建省布氏菌分離株MLVA-16基因型聚類分析MST圖Fig.5 Clustering analysis (minimum spanning tree for categorical data) based on MLVA-16 genotype data, showing relationships between the 40 Brucella isolates from Fujian Province and 147 other strains from different regions in China

福建省布病全年均有病例報告，發(fā)病高峰期在4-8月，其季節(jié)性變化與羊種布氏菌人間發(fā)病高峰一致，與羊群產羔及流產季節(jié)密切相關[13]，結合分離菌株羊種占比高達87.5%，說明福建省流行的優(yōu)勢布氏菌種為羊種布氏菌。福建省近幾年男性布病發(fā)病率高于女性，男女性別感染布病的區(qū)別可能取決于男性從事畜牧業(yè)生產及屠宰等活動較多，與病畜接觸機會較高導致，但沒有性別敏感性差異[13]。任何年齡組人群對布氏菌皆易感，發(fā)病年齡以40～64歲為主，同樣是取決于病畜接觸機會[14]，因為青壯年作為主要勞動力，與病畜接觸頻繁而導致其感染機會增高。福建省布病發(fā)病仍然以農牧民等職業(yè)人群為主，但近幾年已經呈現家務及待業(yè)、離退人員、商業(yè)服務、學生等非職業(yè)性感染增多的趨勢，說明目前布氏菌的感染因素和途徑更加復雜化，菌株毒力較強，偶然接觸即可被感染。

本研究選用的3種基于PCR技術的布氏菌分子鑒定與分型方法(BCSP31-PCR、AMOS-PCR和MLVA-16)，基本可以完成國內主要引起人感染的流行菌種(型)鑒定，可以用來彌補傳統(tǒng)布氏菌種型鑒定中的不足[15]。通過對40株福建省布氏菌分離株的檢測結果也與傳統(tǒng)分型基本一致，兩者綜合顯示福建省的布氏菌為2個種(羊種和豬種)和2個生物型(羊3型和豬3型)，其中羊種布氏菌占絕大多數(87.5%)，以羊3型為福建省當前主要流行菌型，提示福建省控制人間布病疫情應重點控制羊的布病疫情。此外，本次研究中分離的人間布氏菌株并未發(fā)現牛種等布氏菌，本省是否存在其它種布氏菌有待于今后分離更多的人/畜間布氏菌株進行驗證。

目前，國際上通用的基于16個位點的布氏菌MLVA分型方法(MLVA-16)，具有快速、操作簡單、重復性好等優(yōu)點，不涉及大量活菌操作，極大地降低了實驗室感染機率，且結果轉化為字符數據類型，便于實驗室間的比較和保存，已在分子流行病學、區(qū)分基因型、種群結構和菌株間親緣進化關系等方面得到廣泛應用，可以作為傳統(tǒng)表型鑒定方法的補充，為布病流行病學溯源提供更多的分子生物學證據。40株布氏菌分離株分別聚類成羊種和豬種2個種群，35株羊種菌在panel 1的8個位點分別為基因42、43和63型，均屬于“東地中海型”(East Mediterranean group)，其中基因42型在省內分布廣泛，同國內其他地區(qū)研究結果一致[9]。Panel 2中的panel 2B的5個位點變異度較高，對分析菌株基因多態(tài)性和相同生物型菌株間的變異更有價值，可將35株羊種菌分為28個基因型，5株豬種菌分為4個基因型，表明福建省目前流行的布氏菌存在著豐富的基因多態(tài)性。

聚類分析結果顯示，福建省分離的部分菌株間存在共享基因型，漳州、南平、寧德和龍巖地區(qū)分離的部分菌株基因型分別一致，提示上述地區(qū)近幾年存在著布病聚集性疫情的可能，與我省近幾年報告的布病聚集性疫情事件基本一致[4]。廈門與漳州、三明地區(qū)分離的部分菌株分別出現共享基因型，提示市場中染疫動物及其制品的跨區(qū)域傳播未得到有效控制，農牧部門應加強畜間疫情監(jiān)測和布病防控措施的落實。不同時間于不同地區(qū)分離得到的布氏菌基因型一致，是因為該基因型長期存在于某一地區(qū)的動物中，發(fā)生了跨區(qū)域運輸與交易引起交叉感染，還是因為購自于同一地區(qū)的患病動物及其制品引起，則需要結合當地畜間布氏菌分子流行病學進行相互驗證，這方面有待于進一步研究。同時，26個分離株表現出不同的基因型，顯示流行病學無關的散發(fā)特征，提示福建省目前布病疫情仍然以散發(fā)為主。值得強調的是，雖然羊種布氏菌為福建省乃至全國當前主要流行菌型，但作為福建省布病疫情較為嚴重的漳州地區(qū)，時常發(fā)生由豬種布氏菌引起該地區(qū)人間布病聚集性疫情[4]，可能與該地區(qū)近幾年養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展，從事養(yǎng)豬、屠宰加工的布病高危人群快速增加，同周邊地區(qū)或省外牲畜交易和流動活躍等有關；并且豬種布氏菌對人致病性更普遍[10]，因此在做好羊種布病防控的同時，漳州地區(qū)亦要加強豬種布病的防控，做好病豬的撲殺補償制度，防止傳染源轉移造成疫情的蔓延。

此外，部分發(fā)病時間相近或發(fā)病地區(qū)相近的同一種型的菌株往往分別聚在一起，顯示出基因型高度相似性，說明在這一年或近幾年同一地區(qū)或相近地區(qū)流行菌株基因型相同或相近，分別存在著優(yōu)勢基因型[12,16-17]。結合菌株分離時間、地區(qū)和患者發(fā)病時間等詳細流行病學資料，聚類在同一基因型別的簇中的這些菌株可能存在共同感染來源(同一群羊或同一群豬)，提示預警信息，可用于發(fā)現布病疫情暴發(fā)關聯，查找危險因素，示蹤傳播途徑，進而追溯傳染來源[17]。

既往研究證實，MLVA-16基因分型結果與流行病學資料有較好的相關性，流行病學相關的分離株顯示相同或非常相似的基因型[18-19]。MLVA-16分型在布病疫情暴發(fā)中流行病學關聯的識別和反向追蹤調查方面，可以作為一個非常實用和重要的分子基因分型工具。通過與國內其他省份布魯氏菌MLVA-16分型結果的聚類分析，顯示福建省與其他省部分菌株存在著高度同源性，如與內蒙古和廣東省菌株甚至出現MLVA-16基因型別一致的現象，其他部分菌株僅在panel 2B出現1～3個位點的差異，提示福建省可能與其他各省之間存在著長期的地區(qū)間牲畜及其制品流通，在加強從布病主要流行病區(qū)牲畜及其制品進入檢疫監(jiān)管力度的同時，亦要防范周邊布病非主要流行病區(qū)染疫動物的流入，若不能加強傳染源的防控力度，勢必會造成本地疫情暴發(fā)和外來輸入性傳播的內外雙重風險的夾擊，給布病防控帶來極大的難度。

綜上所述，針對福建省布病疫情和分子流行病學特征，建議：1)農牧部門應加強畜間布病監(jiān)測(包括病原學監(jiān)測)，增強畜間檢疫及布病動物撲殺等措施落實，做到從源頭防控布病動物的流通擴散；2)衛(wèi)生部門應加強基層醫(yī)務人員布病診療水平、醫(yī)院實驗室診斷能力和職業(yè)人群及密切接觸人群的健康教育與行為干預，做到人間布病早發(fā)現、早診斷和早治療；3)建立以政府為主導，多省市多部門協(xié)助的聯防聯控機制，定期相互通報人/畜間布病疫情；4)盡快建立適合于基層推廣應用的布病診斷和布氏菌分型新方法，并應用于日常布氏菌監(jiān)測和疫區(qū)的布病防治工作中，與傳統(tǒng)布病防控方法相結合，做到真正意義上的早期預警和流行病學溯源，及時提示預警信息，追溯傳染來源，有助于分析布病疫情及流行趨勢，為防控策略的制定和實施提供科學依據。

利益沖突：無

引用本文格式：韓騰偉,林代華,劉菁,等.福建省2008-2017年人間布魯氏菌病流行特征及分離株MLVA分型研究[J].中國人獸共患病學報,2019,35(5):382-388.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.059