陳桂玲 張玉然 張 曉 朱友雙 趙全義

（1 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院 山東日照 276826 2 蘭州大學(xué)藥學(xué)院 甘肅蘭州 730000）

甘草酸（GL）可以被β-葡萄糖醛酸苷酶催化選擇性地水解為單葡萄糖醛酸甘草次酸（GAMG），GAMG 作為甘草酸的衍生物，具有較甘草酸更為顯著的抗癌、抗炎等藥理作用，其極性適中，更易被人體吸收，生物利用度高。此外，GAMG 還可作為一種新型的天然甜味劑，在醫(yī)藥和食品工業(yè)領(lǐng)域具有重要的研究?jī)r(jià)值［1-3］。 目前對(duì)GAMG 的制備及研究主要集中在生物轉(zhuǎn)化方面， 即利用甘草酸水解制備GAMG，其中常用的溶劑為磷酸緩沖液，但在實(shí)際生產(chǎn)中具有轉(zhuǎn)化效率低、產(chǎn)物不穩(wěn)定等缺點(diǎn)［4］。 近年來(lái)，對(duì)新型有機(jī)溶劑反應(yīng)體系的開(kāi)發(fā)成為甘草酸選擇水解制備GAMG 的研究熱點(diǎn)。

室溫離子液體（room temperature ionic liquid，IL）是指由離子構(gòu)成且在常溫下呈液態(tài)的化合物，由于其具有促進(jìn)反應(yīng)速率、提高反應(yīng)選擇性、實(shí)現(xiàn)反應(yīng)過(guò)程的綠色化等優(yōu)勢(shì)，作為綠色高性能反應(yīng)介質(zhì)已經(jīng)得到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，近年來(lái)許多生物催化反應(yīng)已經(jīng)成功地在離子液體系中實(shí)現(xiàn)［5-7］。

本論文選擇2 種不同的離子液體系，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（［Bmim］PF6）與1-丁基-3-甲基溴化咪唑（［Bmim］Br），并利用從鴨肝中粗提取得到的β-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行催化反應(yīng)， 探討離子液體系中甘草酸的選擇性水解反應(yīng)特性。為建立高效的β-葡萄糖醛酸苷酶選擇催化甘草酸生成GAMG 的反應(yīng)體系提供一定的理論依據(jù)，提高GAMG 的產(chǎn)率，更好地服務(wù)于醫(yī)藥和工業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甘草酸（甘肅蘭特植物化學(xué)品有限公司）、酶溶液（自制）、離子液［Bmim］PF6與［Bmim］Br（蘭州生物化工有限公司）、磷酸緩沖液（pH=6.0）、丙酮（AR）、色譜甲醇、乙酸乙酯（AR）。

1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀（Waters 600泵、2998 型PDA 紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、2414 型柱溫控制系統(tǒng)、2707 型自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司），色譜柱為SunFire C18（4.6×150 mm，5 μm，Phenomenex Inc.， Torrance，CA，美國(guó)）、組織勻漿機(jī)、Discovery 十萬(wàn)分之一天平、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（PekinElmer Lambada 25）、臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Hermle Labortechnik GmbH Z36HK）、RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、79-3 型恒溫磁力攪拌器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 β-葡萄糖醛酸苷酶的制備 取新鮮鴨肝，除結(jié)締組織后剪碎，制備組織勻漿，用-20℃預(yù)處理的丙酮、乙醚抽提除脂類(lèi)，真空干燥除去有機(jī)溶劑，將得到的酶干粉溶于磷酸緩沖液 （PBS，pH=6.0），進(jìn)行差速離心（分別以1 500× g 離心30 min，12 000× g 離心20 min，28 000× g 離心10 min），收集上清液置于60℃水浴鍋中熱變性10 min，離心除去沉淀;上清液中加入硫酸銨至50%飽和度鹽析,透析除鹽，最終得到β-葡萄糖醛酸苷酶的粗酶溶液。

1.3.2 β-葡萄糖醛酸苷酶在離子液中的催化反應(yīng)向3 mL 的溶劑反應(yīng)體系中加入0.0082 g 甘草酸及2 mL 自制酶溶液，于55℃磁力攪拌加熱反應(yīng)。2 h 后酸化終止反應(yīng)，然后向每個(gè)試管中加入5 mL乙酸乙酯進(jìn)行多次反復(fù)萃取，合并萃取液進(jìn)樣高效液相檢測(cè)。 對(duì)離子液濃度、底物濃度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行探討，除控制變量之外，反應(yīng)條件同上。

1.3.3 酶活力的測(cè)定方法 反應(yīng)進(jìn)程通過(guò)高效液相進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙酸=75∶25∶5,流速為0.8 mL／min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

產(chǎn)率的計(jì)算方法為產(chǎn)物GAMG 的峰面積與檢出峰總面積（包括反應(yīng)底物甘草酸GL 的峰面積與反應(yīng)產(chǎn)物GAMG 或者最終產(chǎn)物甘草次酸GA的峰面積總和）的比值乘以100%。

在離子液［Bmim］Br 中β-葡萄糖醛酸苷酶可以把甘草酸選擇性地催化水解為GAMG。高效液相跟蹤酶催化的甘草酸水解反應(yīng)進(jìn)程如圖1 所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑效應(yīng) 選取H2O、［Bmim］Br、 乙酸乙酯（ethyl acetate）、PBS 緩沖液 （pH＝6.0）、［Bmim］PF6共5 種不同反應(yīng)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)。 結(jié)果如圖2所示， 反應(yīng)2 h 后， 不同溶劑系統(tǒng)中GAMG 的產(chǎn)率差異比較顯著。 其中以0.05 mol/L 的離子液［Bmim］Br 中產(chǎn)率最高，為78.38%，比PBS 緩沖液高近10%；而另一種離子液［Bmim］PF6反應(yīng)進(jìn)程較慢，僅為28.45%。其原因可能是［Bmim］Br 為一種親水性的離子液，與PBS 緩沖液相比較，它的溶劑極性較強(qiáng)， 更易于極性分子底物甘草酸的溶解，而［Bmim］PF6是疏水性的離子液，甘草酸不容易在此離子液中溶解。

有研究報(bào)道［8-9］，離子液會(huì)導(dǎo)致酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，使其活性降低或者喪失，進(jìn)而影響反應(yīng)進(jìn)程，這可能是2 種離子液中產(chǎn)率顯著不同的原因。 為了對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)紫外光譜法對(duì)不同溶劑對(duì)酶蛋白的影響作出探討。 結(jié)果如圖3所示，β-葡萄糖醛酸苷酶在［Bmim］Br 中紫外吸收（曲線d）較其他溶劑發(fā)生了明顯變化，最大吸收峰值為236.8 nm，而在水中為193.6 nm，表明酶的特征吸收峰在離子液中發(fā)生比較明顯的紅移。 ［Bmim］Br 中較強(qiáng)的紫外吸收表明β 葡萄糖醛酸苷酶可能在該離子液中得到高度的分散，幾乎是以單個(gè)分子的形式存在，這種高分散度的構(gòu)象分布有利于酶與底物的相互作用，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行。

2.2 離子液濃度效應(yīng) 如圖4 所示， 在［Bmim］Br的低濃度范圍（0.01～0.06 mol/L）內(nèi)，甘草酸水解生成GAMG 轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高，且反應(yīng)速率隨離子液濃度的增高而呈線性上升，當(dāng)［Bmim］Br 的濃度為0.06 mol/L 時(shí)，GAMG 產(chǎn)率最高。 但當(dāng)［Bmim］Br的濃度超過(guò)0.06 mol/L 時(shí)，反應(yīng)速率急速下降。這可能與高濃度的離子液粘度太大， 不利于溶質(zhì)分子的擴(kuò)散，抑制了反應(yīng)進(jìn)程有關(guān)。對(duì)［Bmim］PF6而言， 在0.02 mol/L 到0.5 mol/L 的濃度范圍內(nèi)，酶催化甘草酸水解生成GAMG 的產(chǎn)率都相對(duì)較低而且變化不大， 說(shuō)明β-葡萄醛酸苷酶在離子液［Bmim］PF6中活性受到限制， 該離子液不適合作為甘草酸水解反應(yīng)的共溶劑。

2.3 底物濃度效應(yīng) 結(jié)果如圖5 所示,當(dāng)[Bmim]Br的濃度一定時(shí)（0.06 mol/L），在甘草酸濃度為0.51～6 mmol／L 的范圍內(nèi)，GAMG 產(chǎn)率隨底物濃度升高而下降。 底物濃度為0.5 mmol／L 時(shí)，反應(yīng)40 min后甘草酸的水解轉(zhuǎn)化率為85.16%， 但當(dāng)甘草酸的濃度高達(dá)4 mmol／L 時(shí)， 該反應(yīng)速率急劇下降，僅有5.41%的產(chǎn)物生成。 結(jié)果表明，低濃度的甘草酸可以提高離子液中水解反應(yīng)的轉(zhuǎn)化速率?？捎梅磻?yīng)性與選擇性的原則解釋?zhuān)邼舛鹊牡孜飼?huì)促進(jìn)反應(yīng)正方向的進(jìn)行，但是同時(shí)也會(huì)降低底物與催化酶之間的立體選擇性，從而對(duì)具有空間選擇性要求的該水解反應(yīng)產(chǎn)生抑制。

2.4 溫度效應(yīng) 如圖6 所示， 在低溫范圍內(nèi)，2種溶劑中的反應(yīng)速率均隨溫度升高而上升。 但在相同低溫范圍內(nèi)，［Bmim］Br 中水解反應(yīng)速率比PBS 緩沖液中高， 說(shuō)明低溫條件下，β-葡萄糖醛酸苷酶在該離子液中也具有較好的催化活性。［Bmim］Br 中β-葡萄糖醛酸苷酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，較PBS 緩沖液降低了10℃。 在PBS 緩沖液中，當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)70℃時(shí)，酶的活性迅速降低，最多有10%的甘草酸實(shí)現(xiàn)水解，而在離子液［Bmim］Br 中，β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，反應(yīng)溫度為75℃時(shí)，產(chǎn)率仍高于50%，說(shuō)明離子液中酶的穩(wěn)定性得到提高。

2.5 反應(yīng)進(jìn)程及產(chǎn)物的穩(wěn)定性探討 GAMG 只是甘草酸水解反應(yīng)的中間產(chǎn)物， 隨著反應(yīng)進(jìn)行，β-葡萄糖醛酸苷酶可繼續(xù)催化最終生成甘草次酸（GA）。對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行探討，結(jié)果如圖7 所示，在［Bmim］Br 中，甘草酸可以在5 h 內(nèi)完全轉(zhuǎn)化生成GAMG，且無(wú)副產(chǎn)物GA 生成。 這與早期研究報(bào)道［10-11］通過(guò)甘草酸選擇水解制備GAMG 的結(jié)果相比較具有很大優(yōu)越性，反應(yīng)速率的提高，極大地縮短了完全轉(zhuǎn)化所需要的反應(yīng)時(shí)間。

從圖7 中還可看出，6 h 后，反應(yīng)系統(tǒng)中開(kāi)始有最終水解產(chǎn)物GA 檢測(cè)到， 但產(chǎn)率一直維持在較低水平，表明在［Bmim］Br 中，β-葡萄糖醛酸苷酶已催化GAMG 水解掉1 分子糖醛酸生成GA，但由于離子液的微粒子溶劑環(huán)境使酶具有較好的立體選擇性， 更加傾向于選擇性地催化甘草酸中β-糖苷鍵的水解而不是催化單葡萄糖醛酸的水解或者甘草酸的2 步水解， 這就使得即使甘草酸已經(jīng)在5 h 內(nèi)完全實(shí)現(xiàn)了第1 步水解轉(zhuǎn)化（GLGAMG），24 h 內(nèi)酶催化進(jìn)行第2 步水解（GAMGGA）的反應(yīng)速率也極大受到限制，從而保證了產(chǎn)物的穩(wěn)定性，利于GAMG 的回收分離。

3 結(jié)論

在離子液［Bmim］Br 中，β-葡萄糖醛酸苷酶可以高效、定向地催化甘草酸進(jìn)行選擇性水解，生成單葡萄糖醛酸甘草次酸。 β-葡萄糖醛酸苷酶在該離子液中活性及熱穩(wěn)定性都能得到一定程度的提高。 當(dāng)離子液［Bmim］Br 濃度為0.06 mol/L，反應(yīng)溫度為45℃時(shí)， 在β-葡萄糖醛酸苷酶的催化下， 反應(yīng)5 h 后甘草酸可以被完全轉(zhuǎn)化生成單葡萄糖醛酸甘草次酸。這表明從鴨肝中純化制備β-葡萄糖醛酸苷酶，并以離子液［Bmim］Br 作為反應(yīng)共溶劑制備單葡萄糖醛酸甘草次酸， 可作為一種高效的反應(yīng)制備體系，其具有一定的應(yīng)用前景。