周佳麗,吳艷陽,羅玉霜,袁玉菊,劉明俊,劉東波,4,5*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院,中國湖南長沙410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院,中國湖南長沙410128;3.國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預技術實驗室,中國湖南長沙410128;4.湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室,中國湖南長沙410128;5.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,中國湖南長沙410128;6.湖南省馬王堆醫(yī)院,中國湖南長沙410128)

糖尿病是一種全球性的、以持續(xù)高血糖癥為特征的代謝紊亂疾病。血糖異常升高的原因可能是胰島素自身分泌缺陷(1型糖尿病,T1D),或肝臟等效應器官產(chǎn)生胰島素抵抗,或胰島素分泌不足(2型糖尿病,T2D)[1]。在T1D和T2D的情況下,持續(xù)高濃度的葡萄糖會引起細胞內(nèi)抗氧化能力的失衡,導致亞硝基介導的氧化應激和損傷。氧化和糖化蛋白的積累是糖尿病相關的常見蛋白質(zhì)修飾,其部分原因可能是自噬缺陷[2]。因此,越來越多的研究認為相關細胞自噬可能有利于糖尿病的治療。β細胞是人體內(nèi)唯一能夠分泌胰島素的功能細胞,研究β細胞的自噬對于糖尿病的治療與控制具有重大意義。相關研究報道,β細胞自噬可通過調(diào)控胰島素顆粒的降解來影響細胞胰島素的釋放[3～4]。

自噬是真核細胞內(nèi)一種高度保守的再循環(huán)過程,它通過降解細胞質(zhì)中的細胞器、蛋白質(zhì)和大分子物質(zhì),對分解產(chǎn)物進行再利用。自噬在細胞存活和功能維持中起著重要作用[5]。細胞自噬由多個步驟組成,其中包括:1)吞噬泡的形成;2)自噬體的形成;3)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體;4)自噬溶酶體的降解[6]。自噬流是這些步驟在細胞內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)的動態(tài)過程,自噬流的活化或受阻往往會形成不同的生物學效應[7]。人們在研究過程中逐漸發(fā)現(xiàn),自噬流受阻可能誘發(fā)多種疾病[7]。微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)是自噬體膜標志物,一般散在分布于細胞質(zhì)[8]。在自噬過程中,胞質(zhì)形式的LC3(LC3-Ⅰ)與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-磷脂酰乙醇胺結合物(LC3-Ⅱ)[9]。紅色熒光點-綠色熒光點-LC3(red fluorescence point-green fluorescence point-LC3,RFP-GFP-LC3)融合蛋白是一種方便的自噬熒光蛋白標記物。在自噬發(fā)生初期,胞漿型LC3轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3,在熒光顯微鏡下可觀察到紅色/綠色共定位的點狀聚集。自噬后期,溶酶體與自噬體融合形成自噬溶酶體,細胞環(huán)境pH發(fā)生變化。當環(huán)境pH＜5時,GFP熒光敏感發(fā)生淬滅,只能檢測到紅色熒光點狀聚集[10]。因此可以通過GFP熒光點與RFP熒光點比例來評價自噬流進程。

目前可通過瞬時轉(zhuǎn)染的方法檢測自噬流,通過在細胞中瞬時高表達RFP-GFP-LC3質(zhì)粒來進行后續(xù)實驗[11],但是瞬時轉(zhuǎn)染的方法具有穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)染效率低等缺點。為解決這一問題,我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構建了能夠穩(wěn)定表達RFPGFP-LC3質(zhì)粒的大鼠胰島β細胞株,這將有利于研究自噬在胰島β細胞中的作用,同時也可將其用于治療糖尿病藥物的初步篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒包裝系統(tǒng)(該病毒系統(tǒng)包括VSVG質(zhì)粒、Δ8.9 質(zhì)粒);293FT 細胞、RIN-m5f細胞株(湖南農(nóng)業(yè)大學亞健康實驗室凍存);DH5α感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術有限公司)。DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Biological Industries公司,以色列);Trypsin-EDTA細胞消化液(北京全式金生物技術有限公司);LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo公司,美國);G418試劑(Sigma公司,美國);防熒光淬滅封片劑(SouthernBiotech公司,美國);SQSTM1/P62(sequestosome 1)抗體、S6K(ribosomal protein S6 kinase)抗體、phospho-S6K抗體(CST公司,美國);GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)抗體[亞太恒信生物科技(北京)有限公司];6×loading buffer(北京全式金生物技術有限公司)。激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710);倒置熒光顯微鏡(Leica DMI8)。

1.2 慢病毒載體構建

慢病毒載體構建由上海吉凱基因科技有限公司完成,構建過程主要參照文獻[12]的方法,簡要概述如下:用PCR從PCMV-RFP-GFP-LC3質(zhì)粒中擴增RFP-GFP-LC3片段;擴增產(chǎn)物10 g/L瓊脂轉(zhuǎn)化,篩選出重組質(zhì)粒,得到RFP-GFP-LC3-GV374質(zhì)粒。經(jīng)過測序比對確認慢病毒載體構建成功(圖1),提取重組質(zhì)粒,純化溶解,-20℃保存。

1.3 慢病毒的包裝制備

用含有10%FBS的DMEM基礎培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293FT細胞,細胞狀態(tài)良好。待細胞匯合至90%左右,將其用含0.25%EDTA的胰酶消化,種入6孔板中,培養(yǎng)24 h。待細胞匯合度達50%左右時,進行換液處理并按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000的說明書進行操作。即將VSVG質(zhì)粒、Δ8.9質(zhì)粒、RFP-GFP-LC3質(zhì)粒進行質(zhì)量濃度1∶1∶1的共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染完成后將細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。到達時間后,于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,并收集細胞上清液,3 000 r/min離心10 min,去除殘余的293FT細胞雜質(zhì),即得到已包裝好RFP-GFP-LC3質(zhì)粒的慢病毒顆粒。

圖1 LC3自噬流檢測慢病毒載體圖譜Fig.1 The vector of lentivirus for detecting LC3

1.4 穩(wěn)定細胞株的篩選

轉(zhuǎn)染前一天,將RIN-m5f用0.25%EDTA胰酶進行消化,種入6孔板中。用含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,將收集的慢病毒顆粒加入細胞培養(yǎng)液中,對細胞進行換液處理。24 h后,在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況,并更換新的培養(yǎng)基。感染約48 h后,加入嘌呤霉素進行篩選培養(yǎng)。預實驗提示RIN-m5f細胞的嘌呤霉素最佳篩選質(zhì)量濃度為6 μg/mL。篩選培養(yǎng)約7 d后,未經(jīng)感染的對照組細胞全部死亡,感染組有陽性克隆細胞生長,熒光顯微鏡下可見RFP熒光與GFP熒光。用0.25%EDTA胰蛋白酶消化陽性克隆細胞,轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)2 d,隨后收集感染病毒的穩(wěn)定細胞株,用細胞免疫熒光的方法檢測RFP-GFP-LC3的表達。

1.5 自噬的誘導及自噬流的檢測

構建成功的細胞以1×105的數(shù)目種入24孔板中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。待細胞匯合至70%左右,對照組使用含10%FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),饑餓組加入無血清1640培養(yǎng)基饑餓2 h,在饑餓+氯喹(chloroquine,CQ)組,使用10 μmol/L的氯喹與饑餓共處理2 h。到達預定處理時間后,用PBS清洗兩遍,將玻片夾出反向固定于載玻片上,于激光共聚焦下拍攝RFPGFP-LC3熒光點。

1.6 Western-blot分析

構建成功的細胞以1×105的數(shù)目種入24孔板中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。待細胞匯合至95%左右,加入無血清1640培養(yǎng)基饑餓處理2 h,在饑餓+CQ組,使用10 μmol/L的氯喹與饑餓共處理2 h。到達預定時間后,用PBS洗滌細胞,每孔加入200 μL 2%SDS細胞裂解液,迅速將細胞刮下收集。每管加入40 μL的6×loading buffer,煮至蛋白質(zhì)變性,蛋白質(zhì)可置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2%SDS-PAGE電泳后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉液室溫封閉1 h,按照1∶1 000的稀釋比例,分別孵育 P62、S6K、P-S6K、GAPDH一抗,4℃過夜,加入對應二抗稀釋液(1∶5 000),室溫孵育1 h,ECL發(fā)光顯影。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 穩(wěn)定細胞系的篩選

慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后,用嘌呤霉素對已轉(zhuǎn)染細胞株進行篩選。大約7 d后,經(jīng)過篩選的細胞如圖2所示,在熒光顯微鏡下觀察到100%表達紅色/綠色熒光,表明穩(wěn)定表達RFP-GFP-LC3的大鼠胰島細胞已經(jīng)建立成功。

2.2 自噬的誘導以及自噬流的檢測

如圖3A所示,在本實驗中可明顯觀察到對照組中自噬體較少且紅色熒光與綠色熒光的表達量一致。經(jīng)過饑餓自噬誘導以后,自噬點顯著增加,細胞中綠色熒光點的表達量顯著低于紅色熒光的表達量。該現(xiàn)象是由于饑餓誘導形成了自噬流,自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體,在自噬溶酶體的酸性環(huán)境下,綠色熒光點發(fā)生淬滅。在對細胞進行饑餓處理的同時加入10 μmol/L的CQ,發(fā)現(xiàn)綠色熒光的表達量較饑餓組略有回升。這是因為自噬阻斷劑CQ部分阻斷了自噬體與溶酶體的結合,從而導致綠色熒光表達量的上升。單個細胞中紅綠熒光點的比值在各組間具有統(tǒng)計學差異(圖 3B)。

2.3 自噬誘導后相關蛋白質(zhì)的表達分析

細胞經(jīng)過無血清饑餓處理2 h后用2%SDS溶液裂解,收集總蛋白質(zhì),采用Western-blot的方法檢測自噬相關蛋白質(zhì)P62及S6K的表達水平。結果如圖4所示,自噬底物P62蛋白的水平下降,與此同時m-TOR活性評價蛋白質(zhì)S6K的磷酸化水平下降,由此證明自噬流被成功誘導,與圖3結果所示一致。

圖2 RIN-m5f細胞的熒光顯微鏡觀察圖(100×)(A)透射光下的RIN-m5f細胞株;(B)綠色熒光下的RIN-m5f細胞株;(C)紅色熒光下的RIN-m5f細胞株。Fig.2 The RIN-m5f cells observed by fluorescence microscopy(100×)(A)Transmitted light image;(B)Green fluorescence image;(C)Red fluorescence image.

圖3 激光共聚焦下觀察RFP-GFP-LC3穩(wěn)定細胞株中自噬體的形成(A)2 h血清饑餓后,RFP-GFP-LC3穩(wěn)定細胞株中自噬體的形成圖(標尺50 μm);(B)圖A中綠色熒光點/紅色熒光點的統(tǒng)計結果。**:P＜0.01,與對照組相比;#:P＜0.05,與饑餓組相比。Fig.3 Observation of autophagy formation in RFP-GFP-LC3 stable cell line under laser scanning microscopy(A)The formation of autophagosomes in RFP-GFP-LC3 stable cell line after serum starvation for 2 h (scale bar 50 μm);(B)The cells were treated as described in(A)and the statistical results of green/red fluorescence points were analysed by SPSS 10.0 software.**:P＜0.01 vs.control group;#:P＜0.05 vs.starvation group.

圖4 無血清饑餓2 h后,Western-blot檢測RFP-GFPLC3穩(wěn)定細胞株中相關蛋白質(zhì)表達水平的變化Fig.4 The protein levels of P62,GAPDH,S6K and PS6K were tested by Western-blot after 2 h of serumfree starvation in RFP-GFP-LC3 stable cell line

3 討論

近年來,越來越多的證據(jù)表明,自噬是一種治療糖尿病的新靶點,具有多種有益作用。同時許多藥物和天然產(chǎn)物通過多種信號途徑參與自噬調(diào)節(jié),包括誘導或抑制自噬[13]。有實驗研究表明傳統(tǒng)中藥消渴平可通過誘導自噬抑制小鼠胰島細胞在高糖培養(yǎng)下的細胞凋亡[14],這對于糖尿病的研究具有重大意義,同時也提示自噬的精準檢測愈發(fā)重要。目前,通過細胞免疫熒光技術以及Western-blot對LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的檢測,并不能完整地反映自噬的整體過程。本實驗通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,將已融合的紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白與LC3蛋白轉(zhuǎn)入RIN-m5f細胞,這樣能夠在較為簡單的共聚焦活細胞拍攝下,清楚觀察到細胞自噬的整個過程,實驗簡便易行。

雙熒光RFP-GFP-LC3體系是比GFP-LC3更全面可靠的自噬定量分析方法。該體系最大的優(yōu)點是不需要外加其他藥物干預,可以同時直觀地判斷細胞自噬活性和自噬流(自噬通量)的變化[15～16]。在本研究中,我們運用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,成功構建了表達RFP-GFP-LC3的大鼠胰島β細胞株,并通過G418進行篩選,運用激光共聚焦拍攝手段進行檢測,發(fā)現(xiàn)細胞最終能100%表達RFPGFP-LC3質(zhì)粒。在此基礎上,根據(jù)RFP與GFP對pH的不同適應度[17～18],通過無血清饑餓誘導細胞自噬,結果顯示:在饑餓條件下,綠色熒光點因溶酶體環(huán)境pH較低發(fā)生淬滅,而紅色熒光點穩(wěn)定存在,因此GFP/RFP熒光點的比值下降;當加入10 μmol/L氯喹部分阻斷自噬流后,LC3無法與溶酶體融合,綠色熒光點數(shù)回升。這一實驗現(xiàn)象符合饑餓誘導的自噬情況[19]。自噬是一個動態(tài)的過程,該雙色熒光體系能夠準確地同時顯示和區(qū)分自噬體和自噬溶酶體,是檢測自噬流的最佳方法[20]。目前,雙熒光RFP-GFP-LC3已經(jīng)逐漸得到許多學者的認可,在自噬相關研究中發(fā)揮了重要作用[21～23]。本實驗中,穩(wěn)定表達RFP-GFP-LC3質(zhì)粒的大鼠胰島細胞株的成功構建不僅解決了傳統(tǒng)自噬檢測手段——細胞免疫熒光技術需要相應一抗/二抗的孵育、實驗成本較大、步驟繁瑣耗時的缺點[24],而且為自噬在糖尿病的相關研究提供了細胞平臺,有利于自噬相關機理藥物在胰島β細胞上的高通量篩選,為糖尿病藥物的開發(fā)提供了便利。