袁景陽,喻宗崗,張明軍,李 闖,姚亞鈴,燕海峰*

(1.湖南農業(yè)大學,中國湖南長沙410128;2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所,中國湖南長沙410131;3.懷化市畜牧水產事務中心,中國湖南懷化418000;4.湖南家禽安全生產工程技術研究中心,中國湖南長沙410128)

很多地方家禽品種在環(huán)境適應、抗逆、抗病以及肉質風味等方面具有獨特優(yōu)勢,構成了我國寶貴的禽類育種基因庫。我國原有的100多個禽品種已有部分滅絕,同時很多目前不受歡迎但可能有著巨大潛在育種價值的品種也即將滅絕,而活體保種場又面臨著如禽流感等大型疫病等風險,因此遺傳資源日益匱乏將成為禽類育種工作者面臨的主要問題。

利用冷凍保存技術,可以將精子、卵、胚胎等置于-196℃的環(huán)境中,使其新陳代謝停止,從而進行保存,在需要時再解凍利用。與活體保種相比,這種冷凍保種技術的優(yōu)點為:1)克服了活體保種中疾病、自然災害、近親交配等困境,有效減少保種經費;2)保存年限長,可達200年以上;3)解凍后種群恢復快[1～2]。

目前禽類冷凍精液受精率極不穩(wěn)定,只有少數國家建立了禽類精子冷凍庫。在鴨精液冷凍研究方面,鐘文[3]利用7%甘油作為冷凍保護劑,對北京鴨與正番鴨精液進行冷凍,分別獲得了62.5%與18.7%的受精率,但未說明是用顆粒還是細管進行冷凍的。韓雪峰等[4]報道,以10%二甲基亞砜和細胞凍存管對金定鴨精液實施冷凍,受精率為65%。劉建忠等[5]利用11%甘油、細管與顆粒,對荊江麻公鴨、洪山公雞的精液實施冷凍,測定其存活率與頂體完整率,發(fā)現公鴨凍精效果均優(yōu)于公雞,同時指出未能完成鴨冷凍精液受精率檢測,因為鴨的人工輸精難度太大。李闖[6]采用不同冷凍保護劑,對精武鴨精液實施冷凍管保存,并檢測了其活力,但也沒有進行受精率檢測。宋興國等[7]對禽類精液保存及鴨的人工授精進行了綜述,指出雞冷凍精液已在美國的原種雞場應用,而對鴨只描述了人工輸精。禽類精液冷凍技術中甘油作為冷凍保護劑因其對禽類的避孕作用,凍精解凍后需要通過5℃離心去掉甘油,方法復雜且精子活力大幅度降低,而用二甲基乙酰胺(dimethylacetamide,DMA)保護劑則不用離心去掉。在凍精包裝方面,細胞凍存管、顆粒等均無法批量制作,也不便于標記、大量與長期保存,只有細管便于商業(yè)化生產。因此,以上鴨精液冷凍技術,要么方法落后,要么沒有進行受精率檢測,無法進行推廣應用。

陽小胡[8]利用甘油細管冷凍黑鳳雞精液,平均受精率達到77.63%;黃琳等[9]利用DMA顆粒冷凍黑鳳雞精液,平均受精率為67.09%;曹江麗[10]利用DMA細管冷凍黑鳳雞精液,最高獲得77.61%的受精率。本文在以上基礎上,對籠養(yǎng)湖南優(yōu)秀地方品種攸縣麻鴨公鴨的精液冷凍技術進行研究,為我國鴨乃至禽類延長公禽在后裔測定中的種用期限,利用精液冷凍保存種質資源彌補活體保種的不足等領域的研究與應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

湖南省畜牧獸醫(yī)研究所單籠飼養(yǎng)、全價日糧飼喂、自動飲水的攸縣麻鴨公鴨43只(170 d),臨武鴨母鴨121只,試驗時間為2017年11月至2018年5月。

1.1.2 實驗儀器與試劑

視頻溫控顯微鏡(HW-39A,江西新怡光學儀器有限公司);恒溫水浴鍋(HH-SI,金壇市醫(yī)療儀器廠);電子冷暖箱(FYL-12MC-B3,北京福意聯醫(yī)療設備有限公司);細管(0.25 mL,法國IMV卡蘇科技股份有限公司);全自動冰點滲透壓計(FM-8P,上海醫(yī)大儀器有限公司);孵化機(德州市德城區(qū)佳裕孵化設備廠);液氮熏蒸裝置(發(fā)明專利ZL201210105884.8)。LR液、B液等稀釋液的配方與配制方法參見已有文獻[9,11]報道。

1.2 方法

1.2.1 精液收集及稀釋

在43只公鴨中挑選按摩敏感的12只進行采精訓練。連續(xù)5 d統(tǒng)計120只母鴨產蛋量,從中挑選出產蛋量穩(wěn)定的30只,分為2組。

采精訓練方式為單人背部按摩法:右手固定公鴨雙腳,利用大腿與腰部聯合固定公鴨的上半部,左手掌心緊貼公鴨髖關節(jié),大拇指與四指分別緊貼公鴨腰兩側,沿尾部方向緩慢按摩與快速撫摸交替進行,按摩到尾部泄殖腔時可采用左右大拇指與食指中指聯合緩慢輕微擠壓刺激公鴨泄殖腔,每天兩次。

采精有兩種方式,一是誘情采精。先選擇1只母鴨,抱住腹部將頭依次伸向籠中的公鴨,記下反應敏感的個體,選擇適合誘情對象。誘情采精時,母鴨綁住雙腿后左手托住放入公鴨籠內,右手調整公鴨位置,等公鴨啄住母鴨頸部的羽毛并站立在母鴨背上,左手迅速拿著采精杯緊貼在母鴨泄殖腔,待公鴨生殖器伸入采精杯中,射出精液。二是按摩采精,采精員坐在凳上,右手大拇指與無名指、小拇指固定公鴨雙腿,食指、中指夾住采精杯,雙腿固定公鴨上半部,使公鴨頭朝采精員左方,左手沿尾部撫摸30次左右,待泄殖腔膨脹變硬,左手食指與中指所夾的采精杯對準泄殖腔后,左手三指在泄殖腔周圍輕緩將生殖器擠壓彈出后可收集精液。

用1 mL注射器吸取體溫預熱的稀釋液于采精杯精液處,精液與稀釋液比例:按摩采精為1∶2、誘情采精為1∶4,將精液稀釋與沖洗后移入5 mL離心管中。用生理鹽水沖洗采精杯,再采下一只。用冷藏箱(5℃左右)將稀釋后的精液迅速帶回實驗室,用移液器吸取10 μL稀釋精液在視頻溫控顯微鏡(物鏡 20×、32 ℃)下檢測精子活力[8]。

（2）制造業(yè)企業(yè)技術創(chuàng)新能力同中間品進口的國際技術溢出效應間呈現明顯的正相關性，且該種正相關性在東部區(qū)域體現的更加明。東、中、西部區(qū)域受到研發(fā)強度同中間品進口的國際技術溢出的協(xié)同干擾較嚴重，人力資本和經濟開放度對西部區(qū)域的影響不顯著。

1.2.2 稀釋液滲透壓篩選

在無菌條件下,吸取LR液6 mL分成3等份,標記為 LR1、LR2、LR3,分別添加 0%、10%、20%無菌蒸餾水并進行滲透壓測定;吸取B液7.2 mL,分成 3等份,標記為 B1、B2、B3,分別添加 10%、20%、30%無菌蒸餾水[11]。

依次采集多只公鴨精液,收集后總量在1.6 mL左右,輕輕混勻,吸取150 μL于離心管中,再移取450 μL LR稀釋液,等溫1∶3稀釋。采集混合精液2 mL,輕輕混勻,吸取200 μL于離心管中,再移取800 μL B液,等溫1∶4稀釋。每個滲透壓組設3個平行樣。

稀釋后精液輕輕混勻,檢測并記錄精子活力,于5℃左右保存。取冷藏精液10 μL,按前述方法每隔一定時間檢測精子活力,根據活力情況確定結束檢測時間。

1.2.3 精液冷凍與活力檢測

將活力為0.5以上的稀釋后精液置于5℃平衡30 min,之后1∶1添加含12%DMA的冷凍保護劑平衡10 min(DMA終濃度為6%),平衡后用細管吸取精液,至細管容積的9/10,利用冷凍裝置第2層將細管在液氮表面熏蒸7 min,再投入液氮冷凍保存10 min以上。將細管從液氮中迅速取出立即在40℃水浴解凍10 s進行抽檢。將活力0.3以上的批次用紗布袋收集,在液氮罐中冷凍保存。

1.2.4 冷凍精液受精率檢測

輸精在上午9:00～10:00進行,每只母鴨凍精與原精輸精量分別為0.2 mL、0.05 mL,首次輸精時間隔48 h后再次輸精,之后輸精間隔為96 h。第一次輸精后第2天開始收集種蛋,收集14 d。淘汰破殼蛋、畸形蛋,每批種蛋(總計3批)采取高錳酸鉀-甲醛熏蒸消毒,在37.5℃、相對濕度為60%條件下進行孵化。

1.3 數據統(tǒng)計與分析

數據經EXCEL軟件處理后,用SPSS 19.0軟件中的Duncan’s進行均值顯著性檢驗與單因素方差分析,結果用平均值±標準差(±s)表示。

2 結果與分析

2.1 鴨精液的采集

在制作采精杯時偶然發(fā)現,用塑料洗瓶材質比玻璃更容易將精液洗脫與收集。根據攸縣麻公鴨的體型,將采精杯高度設計為7.5 cm,并將杯口切開4 cm斜口以便于其生殖器自然伸入。誘情采精時僅需要把沒有切口的半邊中心點緊貼在母鴨泄殖腔即可,整個切口都用封口膜包裹,可以適當保護公鴨生殖器。由于每次能采出的精液量不多,這些改進能顯著提高精液收集效率。

43只公鴨中,訓練時建立性反射的共12只(占27.9%),其中適合誘情的有7只,剩下的5只則采用按摩采精方式,誘情與按摩的采精量范圍分別為0.22～0.43 mL與0.12～0.20 mL,平均采精量分別為0.30 mL、0.16 mL,誘情采精精液量明顯多于按摩采精的量(圖1)。

圖1 不同方式下不同公鴨個體的采精量Fig.1 The semen volume of drakes collected by different methods

2.2 精液稀釋液滲透壓對鴨精子活力的影響

采用3種不同滲透壓的LR稀釋液對鴨精液進行保存并定點檢測精子活力,結果顯示:在相同時間點各組活力沒有顯著差異(P＞0.05),在150 h檢測時,3組精子的活力均為0;在相同時間段,如0～24 h與 24～125 h,只有 215 mOsm/kg組活力顯著下降(P＜0.05),其他兩組活力下降不顯著(P＞0.05,表1)。

就LR液3組滲透壓中精子活力隨時間變化的趨勢而言,在215 mOsm/kg至303 mOsm/kg的滲透壓范圍內,呈現滲透壓越高稀釋后保存精子的活力越好的趨勢;同時精液稀釋后3組精子活力均隨時間延長呈逐漸下降的趨勢(圖2)。

以3種不同滲透壓的B液對鴨精液進行保存時,與LR液相同,在相同時間點3種不同滲透壓稀釋液保存的精子活力沒有顯著差異(P＞0.05);同時,0 h與48 h時間點的精子活力也沒有顯著差異(P＞0.05),但均顯著高于96 h時間點的精子活力(P＜0.05)。另外,B液的96 h與LR液的125 h時間點精子活力相似,說明在精子存活時間上LR液優(yōu)于B液。但在0～48 h時間段內,B液的精子活力高于LR液的精子活力,說明B液可能適合短期保存(表 2)。

此外,在0～96 h時間段,B液所保存精子的活力呈現中間高、兩端低的趨勢,而LR液在0～125 h時間段所保存精子的活力則呈現一直下降的趨勢,這可能是因為B液比LR液對攸縣麻鴨精液的稀釋打擊更大,而這種打擊又能恢復。

圖2 不同滲透壓LR液中精子活力的變化趨勢Fig.2 The vitality trend of sperm stored in LR with different osmotic pressures

2.3 鴨冷凍精液解凍后的活力分析

由表3可知,誘情組原精活力的均值為0.71,冷凍后活力均值為0.33,冷凍后損失活力率為54%;按摩組的原精活力平均為0.61,冷凍后活力均值為0.19,且凍前凍后活力損失達68%,均未達到輸精要求。

2.4 冷凍精液解凍后輸精的受精率分析

表1 不同滲透壓LR稀釋液對精子保存活力的影響Table 1 The vitality of sperm stored in different osmotic pressures of LR diluents

就受精率而言,凍精組第1批(2～6 d)的平均受精率最高(為93.8%),而原精組第3批(11～14 d)的平均受精率最高(為92.3%)。就受精率達100%的時間點而言,凍精組有3次,均出現在輸精后間隔 2 d 或 3 d,分別在 5 d(11/11)、8 d(13/13)、12 d(12/12);原精組有4次,在輸精后間隔2～4 d均有出現,分別在 5 d(14/14)、10 d(9/9)、12 d(12/12)、14 d(7/7)。湯樹生[12]報道誘情采精時公番鴨的平均射精量為1.07 mL、密度為1.85×109/mL,原精輸精量0.2 mL的平均受精率為82.46%,輸精后間隔2 d與3 d的受精率達到100%,與本文凍精組情況類似。

表2 不同滲透壓B液對精子保存活力的影響Table 2 The vitality of sperm stored in different osmotic pressures of B diluents

表3 不同采精方法下鴨精液冷凍前后活力的比較Table 3 Semen vitality before and after freezing using different collection methods

就受精率變化趨勢而言,除最后一次外,凍精組與原精組的趨勢基本一致。但是,原精組受精率比凍精組受精率稍穩(wěn)定,在2 d、6 d、10 d輸精后,受精率在輸精后的第1天出現降低,最低降到64.3%,但在第2天又會上升;凍精組在7 d、11 d、14 d出現最低受精趨勢,最低達到了52.7%。需要指出的是,兩組受精最低的情況都是在第7天出現。

凍精組與原精組的受精率、孵化率的平均值相似。在第3次輸精后,原精組產蛋量下降,導致種蛋總數少于凍精組(表4)。本文輸精間隔為4 d,如果輸精間隔為2 d或者3 d,那么受精率會更高(圖3)。凍精組活力在0.3以上、輸精量為0.2 mL,而原精沒有進行稀釋,單次輸精量為0.05 mL,同時原精與凍精公鴨年齡也不同,這可能是導致凍精組孵化率略高于原精組的原因。

3 討論

3.1 影響人工采集鴨精液質量的因素

種鴨精液質量受很多因素的影響。辛清武等[13]報道誘情采精時金定鴨的平均射精量為0.78 mL、密度為1.67×109/mL。韓衛(wèi)杰等[14]報道按摩采精時斑嘴鴨的平均采精量為0.8 mL、密度為8.0×108/mL。劉建忠等[5]報道,荊江麻鴨公鴨接受按摩采精時的精液量為0.2～0.4 mL。這些說明不同品種與精液采集方式對公鴨精液質量有很大影響。季從亮等[15]報道,種鴨周齡對受精率和孵化性能影響顯著,在產蛋后期(15～24周),孵化性能顯著下降。本文同批公鴨45周齡以后的凍精質量也遠不如前期的,其中年齡可能是主要原因。

本文誘情采精量平均0.3 mL,與上述劉建忠等[5]報道的荊江麻鴨按摩采精量相近,但低于其他鴨種的采精量。關于文中的精液冷凍效果,誘情采精方式均優(yōu)于按摩采精方式,因此鴨的采精應以“誘情為主、按摩為輔”的方式。利用誘情方式采集精液,公鴨銜脖、踩背、調位射精等一系列步驟最快可在5 s內完成,且精液的采集由于多次采精杯干擾也容易致使公鴨應激,導致射精方式的改變,從而導致采精的失敗,如果在杯內覆一層封口膜,則能減輕生殖器碰壁損傷。此外,我們在實驗中發(fā)現,1只誘情母鴨在誘情3只公鴨后就已經很累,如果能做出標本母鴨,甚至仿生母鴨生殖道器具,可能會增強公鴨采精體驗,同時減輕母鴨傷害,提高采精成功率。對于水禽,如何推廣籠養(yǎng),有效地采集精液,降低采精與輸精勞動力成本,是水禽人工輸精技術推廣的前提。本文通過優(yōu)化采精模式,制作采精杯,篩選精液稀釋液等,能在減輕公鴨采精應激、簡化采精操作與提高精液利用率等方面為鴨人工授精技術的推廣提供技術參考。

圖3 輸精間隔時間與受精率Fig.3 The fertilization rate at different insemination intervals

表4 凍精組與原精組的受精率與孵化率檢測Table 4 Fertility and hatchability of the frozen and fresh semen samples

3.2 鴨精液冷凍技術的影響因素

精液稀釋液滲透壓的篩選是精液冷凍技術的基礎。采克俊等[16]報道雞精液稀釋液的滲透壓范圍為295～420 mOsm/kg,在高滲環(huán)境中雞精子會出現“暫時性休克”,即剛稀釋后觀察活力為零,隨時間的延長活力逐漸回升(與本文B液稀釋鴨精液情況相似),但精子生存指數較低,說明雞精子對高滲環(huán)境的適應需要一定時間,而且適應能力很有限。本文發(fā)現LR稀釋液滲透壓最小的215 mOsm/kg組中精子活力隨時間變化明顯,說明LR稀釋液的滲透壓越小對精子活力影響越大,可能與上述高滲透壓對精子影響的原理一樣。王曉娟等[11]報道,雞精子活力在B液中的滲透壓最低組(261 mOsm/kg)較好(但差異不顯著),這與本文鴨精液在B液中也是滲透壓最低組較好(但差異不顯著)的趨勢一致,但雞精子存活時間可達386 h,遠遠高于在相同B稀釋液中鴨精子存活時長。同時,本文鴨精液在LR液不同滲透壓中的活力變化趨勢與B液不同滲透壓中的活力變化趨勢不一樣。這些說明鴨精液與雞精液對不同稀釋液以及滲透壓的適應性有區(qū)別。

禽類精子在外觀和大小上大體是相似的,均為棒狀與長尾型,只是雞精子尾部更長,雞、鴨精子總長度分別為 90～100 μm、56.3～71.9 μm,在精液冷凍技術研究時往往同時進行。Tselutin等[17]采用DMA與顆粒凍精,60～70℃專用裝置或水浴解凍,每3 d(火雞為7 d)左右每次每只母禽輸精0.05～0.2 mL,結果顯示鴨、鵝、火雞、雞的凍精受精率分別為 69%～90%、81%～90%、80%～90%與75%～85%,雞的相對較低,但相差也不大,這是國際報道的最好結果。劉建忠等[5]采用相同的冷凍技術對公鴨與公雞的精液進行處理,發(fā)現解凍鴨精子存活率和頂體完整率都不同程度地高于相同類型的公雞凍精,這也許與精子尾部長度不同有關,因為哺乳動物精子普遍比禽類耐凍,而哺乳動物的精子為蝌蚪狀,比禽類的更短。因此,雞與水禽精液用相同冷凍技術,雖然有小的差異,但還是可行的。本文采用了曹江麗[10]報道的雞精液冷凍方法冷凍鴨精液,獲得的受精率比雞的更高,也高于近幾年國內外同類報道。由此也可以預測,本文所報道方法,很有可能適合其他的禽類。

4 結論

本文將前期雞精液冷凍技術研究中篩選出的簡單、便攜且能在資源場實施的冷凍方案應用于麻鴨精液冷凍,獲得了高于目前報道的受精率,提示該方法在禽類有一定的通用性。由于公禽種用期限很短,而后裔測定所需時間較長,常發(fā)生根據后裔測定結果篩選出好的公禽時該公禽已經喪失了繁殖能力的情況,而本文精液冷凍技術則可進行彌補。因此,本文為我國鴨乃至禽類延長公禽在后裔測定領域種用期限,利用精液冷凍保存種質資源彌補活體保種的不足等領域的研究與應用提供了技術支撐。