胡溫溫,ALTAF Simair,呂縝一,陳 婷,張云龍,陸昌瑞

(東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,中國上海201620)

CBX7(chromobox 7)是多梳家族(polycomb group,PcG)蛋白的成員,在細胞增殖和癌癥發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。PcG蛋白是果蠅同源異型基因(homeotic gene,HOX)表達的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn)其在一系列癌癥類型中被解除調(diào)控[1～5]。PcG蛋白形成的多蛋白復(fù)合物(polycomb repressive complexes,PRCs)通過表觀遺傳機制引起染色體結(jié)構(gòu)的改變和基因表達的轉(zhuǎn)錄抑制,從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)組織并將其維持在轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)[1,6～7]。有關(guān)研究證明這些典型和非典型的PRCs(不依賴于轉(zhuǎn)錄抑制的方式對細胞和致癌功能進行調(diào)節(jié)的PcG蛋白)在胚胎發(fā)育、細胞增殖和分化、胚胎干細胞維持以及多功能干細胞的自我更新與維護過程中發(fā)揮重要作用[3～5,8]。PRCs基本上包括PRC1和PRC2,經(jīng)典PRC1的組成如圖1A所示。位于染色體22q13.1上的CBX7編碼一種CBX(chromobox)蛋白,該蛋白質(zhì)目前已被鑒定為PRC1的核心成分[9～11]。Pc蛋白是PRC1蛋白復(fù)合體的核心組分之一,哺乳動物中與Pc同源的CBX蛋白的已知結(jié)構(gòu)域如圖1B所示:CBX蛋白主要由N端chromodomain、C端Pc box(C-terminal polycomb repressor box)以及鄰近N端的AT HOOK或AT HOOK Like(ATHL)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,果蠅Pc蛋白不含有AT HOOK或ATHL結(jié)構(gòu)域[12]。CBX7在人類和小鼠中的結(jié)構(gòu)域分布如圖1C所示,其中在人類和小鼠中的CD(chromodomain)結(jié)構(gòu)域均為11～60 aa,CBX家族C端結(jié)構(gòu)域在人類CBX7中為209～240 aa(https://www.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/4mn3/protein/1),在小鼠中則是116～147 aa(https://www.ebi.ac.uk/pdbe/entry/pdb/4x3t/protein/1),以上分布情況來自PDB數(shù)據(jù)庫。

作為PcG家族的成員,PRC1和PRC2共同誘導(dǎo)組蛋白共價翻譯后修飾(H3K27me3)[13]。當(dāng)PRC1亞基對組蛋白H2A(H2AK119Ub1)進行單泛素化時,PRC2亞基催化組蛋白H3lysine27(H3K27me3)的三甲基化[14],由于這兩種組蛋白的翻譯后修飾與轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān),而CBX7在此過程中結(jié)合H3K27me3并促使H2AK119Ub1泛素化,其重要性不言而喻。此外,CBX7還可以在各種癌癥的起始和發(fā)展中獨立發(fā)揮作用[11,13～18]。但是,CBX7在癌癥發(fā)展中的作用尚存在爭議:對于不同的細胞環(huán)境和癌癥類型,CBX7既可以充當(dāng)致癌因子也可以成為腫瘤抑制因子[11,13～18]。值得注意的是,CBX7也被證明可以正向調(diào)節(jié)前列腺細胞和造血干細胞的干細胞特性[19～20]。最近研究表明,CBX7 mRNA的高表達與癌癥患者預(yù)后密切相關(guān)[21～22],CBX7的CD結(jié)構(gòu)域通過與ncRNA(ANRIL)互作[23]實現(xiàn)對細胞衰老的調(diào)控,成為包括癌癥在內(nèi)的重大疾病診斷的潛在分子標志物及藥物治療的分子靶標[24～25]。

目前,關(guān)于CBX7結(jié)構(gòu)研究的報道僅有兩篇[26～27],分別解析出的是N端7～62 aa與C端219～248 aa區(qū)域的結(jié)構(gòu),但并未指明具體作用位點及機理。對于CBX7的分子生物學(xué)機理及其以何種信號通路發(fā)揮作用,我們尚不明確。本實驗旨在利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建重組克隆并純化出高純度CBX7部分功能結(jié)構(gòu)域單體,為后續(xù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ),同時為CBX7與PcG家族蛋白在癌癥發(fā)展及腫瘤因子靶向抑制等相關(guān)領(lǐng)域中的機制探索提供新的思路和途徑。

圖1 CBX7家族蛋白概況(A)含有CBX蛋白的經(jīng)典PRC1模式圖;(B)果蠅Pc蛋白及人源5種CBX蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖[12];(C)CBX7在人類和小鼠中的結(jié)構(gòu)域分布圖。Fig.1 General information about CBX7(A)The CBX in canonical polycomb repressive complex 1(PRC1);(B)Pc from Drosophila melanogaster and CBXs from Homo sapiens[12];(C)CBX7 structural domains in Homo sapiens and Mus musculus.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、表達載體和基因信息

感受態(tài)細胞DH5α、BL21(DE3)均由本實驗室自制。所使用的pp-SUMO表達載體是經(jīng)過改良之后含有6個SUMO標簽的pET28a載體,選取的酶切位點是BamH I/Xho I。全長CBX7序列由生工生物工程(上海)股份有限公司(以下簡稱“生工”)合成并插入pUC57質(zhì)粒作為PCR擴增反應(yīng)的模板;CBX7蛋白的基因序列根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性進行優(yōu)化和改進,保留原有野生型蛋白質(zhì)序列,可以進行后續(xù)實驗。

1.1.2 試劑與儀器

Pfu DNA聚合酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自生工;DNA D2000 marker購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I購自美國NEB公司;上樣緩沖液5×SDS loading dye由本實驗室自制;DNA marker B600022、蛋白質(zhì) marker BM525、蛋白質(zhì)預(yù)染marker及親和層析介質(zhì)Ni-NTA sefinoseTMresin購自生工;蛋白質(zhì)marker 26610、預(yù)染marker 26616購自美國Thermo Fisher Scientific公司;HiTrap Q FF 5 mL預(yù)裝柱、Superdex200 10/300 GL預(yù)裝柱購自美國GE公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。各階段所用溶液及緩沖體系見表1。

核酸凝膠成像儀、PCR儀、蛋白質(zhì)凝膠成像儀均購自美國Bio-Rad公司;離心機、紫外分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific公司;AKTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)購自美國GE公司;FPLC蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)購自蘇州賽譜儀器有限公司。

1.2 方法與步驟

1.2.1 SUMO-CBX7融合基因的構(gòu)建

通過在線軟件(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測出人源CBX7蛋白的二級結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)中氨基酸序列的無序分布圖,從而判斷出其結(jié)構(gòu)域邊界并據(jù)此設(shè)計需要表達片段的引物。CBX7基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后,在大腸桿菌中能夠高效表達,以該序列作為PCR模板,用引物5′-aaaaGGATCCGCTCACAAATAT-3′和 3′-aaaaCTCGAGTAATAACGCGGTAATATCG-5′進行常規(guī)PCR,擴增出目的序列。經(jīng)過改良后的pp-SUMO載體可增加蛋白質(zhì)的可溶性高效表達,將BamH I和Xho I雙酶切后的pp-SUMO載體和目的序列進行連接和轉(zhuǎn)化,構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒需要進行測序并鑒定。

1.2.2 SUMO-CBX7重組基因的表達鑒定

將測序成功的SUMO-CBX7質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細胞,經(jīng)卡那霉素抗性篩選后,挑取陽性單克隆于37℃搖床培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)的工程菌以1/100比例加入5 mL培養(yǎng)基中,卡那霉素占比0.1%,37℃、225 r/min培養(yǎng)至OD6000.5～0.6。加入1 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG),于 37℃進行快速誘導(dǎo)表達,約4 h后留樣,進行SDS-PAGE和Western-blot鑒定。

1.2.3 SUMO-CBX7融合蛋白的親和純化

取1～2 L誘導(dǎo)表達后的菌液,4℃條件下3 500 r/min離心30 min。將離心后的菌液去上清,沉淀用冰冷的binding buffer重懸,破碎細胞之前加入100 μL的苯甲基磺酰氟(phenylmethane-sulfonyl fluoride,PMSF)(100 mmol/L)混勻,破碎第一遍后再次加入100 μL的PMSF混勻并繼續(xù)破碎,破碎之后的細胞懸液需經(jīng)過高速離心分離上清和沉淀,其中離心速度為12 000 r/min,時間為1 h。將保存在20%乙醇的Ni-NTA預(yù)裝柱用ddH2O沖洗干凈,用多于5 CV(column volume)的binding buffer平衡,上清液過兩遍使目的蛋白與Ni-NTA柱內(nèi)介質(zhì)充分結(jié)合。然后分別用多于5 CV的wash buffer和elution buffer洗脫雜蛋白并收集目的蛋白。各步驟分別留樣并用12%SDS-PAGE和Western-blot檢測鑒定。

表1 溶液及緩沖體系Table 1 Buffers used in this study

1.2.4 離子交換層析

Relianx色譜儀的離子交換層析操作系統(tǒng)如下:選用HiTrap Q FF 5 mL預(yù)裝柱,起初設(shè)置低速流出20%乙醇,用多于5 CV的ddH2O沖洗柱子,然后用2～3 CV 1 mol/L NaOH沖洗,接下來繼續(xù)用多于5 CV的ddH2O沖洗柱子,使用5 CV無鹽buffer平衡,上樣200～500 μL蛋白質(zhì)濃縮樣品,設(shè)置鹽濃度梯度(將含NaCl濃度為1 mol/L的ion-exchange buffer按照1%～100%的體積比與無鹽buffer混合以改變洗脫液鹽濃度,此處可直接在程序中設(shè)置)沖洗,收集UV280以及UV254吸收峰處的蛋白質(zhì)洗脫樣品,留樣并用12%SDSPAGE進行檢測與分析,最后將樣品濃縮。

1.2.5 分子篩層析

AKTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)的分子篩層析操作如下:選用Superdex200 10/300 GL預(yù)裝柱,起初設(shè)置低速流出20%乙醇,用1.5 CV的ddH2O沖洗柱子,然后用1～1.5 CV size-exclusion buffer平衡,接下來上樣250 μL蛋白質(zhì)濃縮樣品,洗脫1 CV,收集UV280以及UV254吸收峰處的蛋白質(zhì)洗脫樣品,留樣并用12%SDS-PAGE進行檢測與分析。最后將樣品濃縮,加入5%甘油,用液氮速凍,置于-80℃冷存。

2 結(jié)果

2.1 SUMO-CBX7重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達

為使目的基因在大腸桿菌內(nèi)可溶性高效表達,我們選擇將目的基因?qū)雙p-SUMO載體中。雙酶切后的pp-SUMO質(zhì)粒長度大約5 600 bp(圖2A)。插入pUC57質(zhì)粒的全長CBX7基因序列作為PCR擴增反應(yīng)的模板,大小約2 000 bp(圖2B)。通過PCR擴增反應(yīng)得到的目的片段CBX7(aa 145～227)如圖 2C 所示,其經(jīng)過 BamH I/Xho I雙酶切后的片段大約249 bp(圖2D)。

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒(圖3A)轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細胞,并加入1 mmol/L的IPTG,于37℃進行快速誘導(dǎo)表達(圖3B,3C)。

2.2 SUMO-CBX7融合蛋白的親和純化

圖2 瓊脂糖凝膠電泳分析CBX7目的片段和pp-SUMO質(zhì)粒載體(A)pp-SUMO質(zhì)粒檢測。M:DNA marker B600022,1:pp-SUMO質(zhì)粒,2:經(jīng)BamH I/Xho I雙酶切后的pp-SUMO質(zhì)粒;(B)CBX7模板質(zhì)粒檢測。M:DNA marker D2000,1:CBX7質(zhì)粒;(C)CBX7(145～227 aa)PCR產(chǎn)物檢測。M:DNA marker D2000,1:CBX7(145～227 aa)片段;(D)CBX7(145～227 aa)PCR 產(chǎn)物酶切檢測。 M:DNA marker D2000,1:經(jīng) BamH I/Xho I雙酶切后的 CBX7(145～227 aa)片段。Fig.2 Agarose gel electrophoresis of plasmid pp-SUMO and CBX7 fragment(A)Analysis of plasmid pp-SUMO.M:DNA marker B600022.1:Plasmid pp-SUMO.2:Plasmid pp-SUMO after BamH I/Xho I digestion;(B)Analysis of CBX7 plasmid.M:D2000 DNA marker.1:CBX7 plasmid;(C)Analysis of CBX7(145～227 aa)fragment.M:D2000 DNA marker.1:CBX7(145～227 aa)fragment;(D)Analysis of CBX7(145～227 aa)fragment after BamH I/Xho I digestion.

融合蛋白N端帶有6*His標簽,可以使用Ni-NTA親和層析對其進行純化。親和層析的純化結(jié)果如圖4所示,過完兩遍的上清(binding flow through)中不含目標蛋白,說明融合蛋白能夠充分與親和介質(zhì)結(jié)合。根據(jù)融合蛋白的性質(zhì)和等電點,各階段選用緩沖液pH 8.0,由于咪唑(imidazole)對分離雜質(zhì)極為重要,選用不同咪唑濃度梯度的wash buffer對雜蛋白進行洗脫,找到合適的洗脫條件(10 mmol/L咪唑wash buffer 10 CV,20 mmol/L咪唑wash buffer 5 CV,50 mmol/L咪唑elution buffer 10 CV收集,多于5 CV 70 mmol/L strip buffer沖洗Ni-NTA柱),最終獲得較為純凈的目的蛋白。

圖3 重組質(zhì)粒的鑒定與表達(A)重組質(zhì)粒檢測。M:DNA marker B600022,1:SUMO-CBX7(aa 145～227)質(zhì)粒;(B)12%SDS-PAGE電泳圖;(C)用于檢測His標簽的Western-blot圖,6*His-tag單克隆抗體來自ProteinTech。M1:蛋白質(zhì)marker 26610;M2:蛋白質(zhì)預(yù)染marker 26616;UN:誘導(dǎo)前的樣品;IN:1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的樣品。Fig.3 Analyses and expression of recombinant plasmid(A)Analysis of recombinant plasmid.M:DNA marker B600022.1:Plasmid SUMO-CBX7(aa 145～227);(B)SDS-PAGE analysis in a 12%polyacrylamide gel;(C)Western-blot using 6*His-tag monoclonal antibody(ProteinTech).M1:Protein marker 26610;M2:Protein marker 26616;UN:Uninduced sample;IN:1 mmol/L IPTG induced sample.

2.3 SUMO-CBX7的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)鑒定

由圖4可知Ni-NTA親和層析可以去除90%雜蛋白,但仍有部分雜蛋白和降解條帶無法分離干凈,因此我們依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)選用HiTrap Q FF(強陰離子交換層析)來繼續(xù)去除雜質(zhì),并利用分子篩層析進一步純化。相關(guān)結(jié)果如圖5、圖6所示,目的蛋白以對稱、尖銳的單峰形態(tài)被洗脫下來,SUMO-CBX7融合蛋白的純度達到97%及以上,已達到結(jié)晶條件。

圖4 經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后的SUMO-CBX7融合蛋白的SDS-PAGE與Western-blot分析(A)12%SDS-PAGE電泳圖;(B)Western-blot圖。M1:蛋白質(zhì)marker BM525;M2:蛋白質(zhì)預(yù)染marker;UN:誘導(dǎo)前的樣品;IN:1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的樣品;SP:上清;PE:沉淀:B:過完兩遍的上清;W5:含5 mmol/L咪唑的洗脫穿出液;10～60:分別為10～60 mmol/L咪唑濃度梯度的洗脫穿出液;E:250 mmol/L咪唑的蛋白質(zhì)收集液;S:含1 mol/L咪唑的洗脫穿出液。Fig.4 SDS-PAGE and Western-blot analyses of SUMO-CBX7 protein purified by Ni-NTA affinity chromatography(A)SDS-PAGE analysis in a 12%polyacrylamide gel;(B)Western-blot using 6*His-tag monoclonal antibody(ProteinTech).M1:Protein marker BM525;M2:Regular range protein marker;UN:Uninduced sample;IN:1 mmol/L IPTG induced sample;SP:Supernatant of cell lysate;PE:Pellet of cell lysate;B:Binding flow through;W5:Washing flow through(5 mmol/L imidazole);10～60:Washing flow through(10～60 mmol/L imidazole);E:Elution fraction(250 mmol/L imidazole);S:Strip flow through(1 mol/L imidazole).

圖5 SUMO-CBX7的離子交換層析純化及鑒定分析(A)SUMO-CBX7離子交換層析純化后的圖譜。紅線:UV254,藍線:UV280;(B)上樣留樣的12%SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白質(zhì)marker BM525,1:上樣留樣;(C)出峰收集液12%SDS-PAGE電泳圖。Lanes 1～12:第38～49 mL收集液留樣,M:蛋白質(zhì)marker BM525。Fig.5 Identification and purification of SUMO-CBX7 by ion exchange chromatography(A)The anion exchange chromatogram of SUMO-CBX7.Red curve:UV254.Blue curve:UV280;(B)12%SDS-PAGE analyses of the injection sample.M:Protein marker BM525.1:Injection sample;(C)12%SDS-PAGE analyses of the collected fraction corresponding to the peak.Lanes 1～12:The corresponding samples of the fractions 38～49.M:Protein marker BM525.

圖6 SUMO-CBX7的分子篩層析純化及鑒定分析(A)SUMO-CBX7的分子篩層析圖譜。紅線:UV254,藍線:UV280;(B)上樣留樣的12%SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白質(zhì)marker BM525;Inject:上樣留樣;1～3:第88～90 mL收集液留樣。Fig.6 Identification and purification analyses of SUMO-CBX7 by size-exclusion chromatography(A)The size-exclusion chromatography of SUMO-CBX7.Red curve:UV254.Blue curve:UV280;(B)12%SDS-PAGE analyses of the injection sample.M:Protein marker BM525;Inject:Injection sample;Lanes 1～3:The corresponding samples of the fractions 88～90.

3 討論

癌癥被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)列為世界五大疑難雜癥之一。近日,世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu) (International A gency for Research on Cancer,IARC)發(fā)布最新報告稱近幾年癌癥發(fā)病率呈上升趨勢,人口老齡化已成為細胞癌變的重要因素之一(https://www.iarc.fr/wp-content/uploads/2018/09/pr263_E.pdf,2018年10月獲取該信息)。PcG蛋白是轉(zhuǎn)錄抑制因子,其調(diào)節(jié)著細胞增殖、細胞衰老、細胞凋亡、細胞癌變等關(guān)鍵發(fā)育和生理過程[28],在人類癌癥發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CBX7作為PcG家族成員PRC1復(fù)合物的重要組分之一,參與多種腫瘤抑制因子轉(zhuǎn)錄沉默機制,與不同類型惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。最近研究表明,miR-19通過抑制CBX7的表達而影響肺癌細胞的增殖、遷移和細胞周期[29]。CBX7在維持胚胎干細胞自我更新和全能性中發(fā)揮重要作用,其表達隨著小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)的分化而減少:CBX7在ESCs中的過表達會增強ESCs的多能性,反之,CBX7的活性喪失,ESCs發(fā)生分化[30]。CBX7是多梳譜系蛋白質(zhì)中研究最為廣泛的代表[31],在細胞衰老和多種癌癥類型中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用,可作為癌癥診斷和預(yù)后中的分子標志物。

然而,CBX7參與細胞增殖、衰老、干細胞分化和多種癌癥類型的分子機制尚未明確。而且,除了已報道的CBX7蛋白C端Pc-box結(jié)構(gòu)域和N端CD結(jié)合結(jié)構(gòu)域的精細三維結(jié)構(gòu)[26～27]之外,CBX7其余部分的功能和結(jié)構(gòu)仍是未解之謎。這對于CBX7相關(guān)的靶向藥物研究極其不利。

本實驗通過在線軟件PSIPRED對人源CBX7蛋白的二級結(jié)構(gòu)以及氨基酸序列無序分布進行預(yù)測(結(jié)果未給出),根據(jù)預(yù)測結(jié)果判斷CBX7功能結(jié)構(gòu)域邊界。同時,結(jié)合在線軟件PredictProtein預(yù)測顯示的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)段170～198 aa,設(shè)計出包含該功能結(jié)構(gòu)域的145～227 aa區(qū)段的引物。在此基礎(chǔ)上,利用大腸桿菌SUMO體外表達系統(tǒng)高效可溶的特點,構(gòu)建出CBX7功能結(jié)構(gòu)域CBX7(aa 145～227)的重組表達載體。隨后,通過Ni-NTA親和層析對融合蛋白進行純化,在Ni-NTA親和層析分離雜質(zhì)時,根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)選擇合適的緩沖液pH以及鹽濃度,可提高純化效率。由于蛋白質(zhì)樣品的復(fù)雜性,需要結(jié)合離子交換和分子篩層析對其進行進一步的純化。通過選擇強陰離子預(yù)裝柱HiTrap Q FF和分子篩層析柱Superdex200對目的融合蛋白和剩余雜質(zhì)進行分離,最終獲得高純度可結(jié)晶的融合蛋白,可為后續(xù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

雖然CBX7與癌癥發(fā)生發(fā)展和干細胞全能性相關(guān),并已成為CBX蛋白家族的研究熱點,但是我們對CBX7(aa 145～227)片段知之甚少。目前,有關(guān)CBX7結(jié)構(gòu)和功能的研究仍處于探索階段。由于CBX7蛋白本身性質(zhì)極不穩(wěn)定,容易降解,且中段結(jié)構(gòu)域可溶性差,所以利用pp-SUMO表達系統(tǒng)提高蛋白質(zhì)可溶性表達并拿到結(jié)構(gòu)域單體非常不易。我們通過純化多達20個不同結(jié)構(gòu)域片段,僅得到文中所述145～227 aa結(jié)構(gòu)域單體。在所純化的20個結(jié)構(gòu)域片段中,有14個片段形成包涵體存在于沉淀中,即使對其進行變性、復(fù)性處理也不能夠得到有活性的蛋白質(zhì);剩下可溶性較好部分全部出現(xiàn)不同程度降解或部分片段從目的片段上斷裂的現(xiàn)象,致使CBX7蛋白的純化工作仍存在巨大挑戰(zhàn)性。本實驗通過對人類CBX7(aa 145～227)功能結(jié)構(gòu)域的原核表達,不斷改善純化體系,首次成功獲得穩(wěn)定且高純度的融合蛋白,可用于結(jié)晶。我們希望通過晶體學(xué)實驗解析出該功能域的精細三維結(jié)構(gòu),并以此為突破點對該區(qū)段的分子學(xué)功能進行探索,分析其分子作用機理和結(jié)合位點,為后續(xù)人類CBX7全長結(jié)構(gòu)研究和PRC1復(fù)合物精細三維結(jié)構(gòu)及功能研究提供科學(xué)依據(jù),同時為PcG家族蛋白在癌癥治療和腫瘤抑制靶向藥物等領(lǐng)域中的研究提供新思路。