李金珂,王玉娜,李麗麗,馬雪征,張麗萍,趙 欣,程 銘,周春雅,王 濤,胡孔新*

(1.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國天津300072;2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)生檢疫研究所,中國北京100176;3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,中國黑龍江哈爾濱150001;4.湖北國際旅行衛(wèi)生保健中心,中國湖北武漢430000;5.杭州蕭山機(jī)場海關(guān),中國浙江杭州310000)

生物氣溶膠(bioaerosol)指的是含有生物活性成分的氣溶膠粒子,往往包含細(xì)菌、真菌、病毒等微生物粒子和孢子、植物花粉、動物碎片等生物體所釋放的微粒成分[1～2],生物粒子大小在 0.01～100 μm之間。雖然生物粒子在空氣顆粒物中所占比例不大,但其長時間懸浮在空氣中,對人體健康的潛在危害不容小視[3]。近些年生物氣溶膠的潛在危害性被越來越多的人重視,2017年6月,以“生物氣溶膠與人類健康、國家生物安全及大氣污染”為主題的學(xué)術(shù)討論會在北京成功召開[4]。

分子生物學(xué)方法是空氣生物學(xué)研究的重要手段。管家基因是指為細(xì)胞的生存提供基本功能,因而在所有細(xì)胞中都表達(dá)的基因,常常作為內(nèi)參基因應(yīng)用于分子生物學(xué)研究中[5]。本研究根據(jù)細(xì)菌、動物和植物3種生物氣溶膠組成成分的管家基因,分別設(shè)計特異引物探針,利用熒光定量PCR方法實(shí)現(xiàn)對不同生物氣溶膠組分的相對定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

病毒氣溶膠采集富集儀BIO Capturer-6由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)生檢疫研究所自主研發(fā),杭州富集生物科技公司生產(chǎn)。文中所用PCR儀為美國ABI公司生產(chǎn)的7500 Fast實(shí)時熒光定量PCR儀。

1.1.2 試劑

磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol/L,pH 7.2～7.4)購自Biosharp公司;磁珠富集液為課題組自制;動物組織、細(xì)菌樣本的核酸提取試劑盒為德國QIAGEN公司的Blood&Tissue Kit;植物組織樣本的提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒;環(huán)境樣本的核酸提取試劑盒為德國QIAGEN公司的DNeasy PowerWater Kit;實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒One-Step RT-PCR Kit購自賽默飛世爾科技有限公司。本研究所用引物探針均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1.2 管家基因引物探針序列的特異性驗(yàn)證

1.2.1 樣本來源

該部分分別利用動植物組織和細(xì)菌樣本對各自管家基因的引物探針進(jìn)行驗(yàn)證。動物組織選用的豬肉、牛肉、魚肉和雞肉樣本,以及植物樣本油菜、萵苣均購自北京大興區(qū)舊宮鎮(zhèn)萬科廣場永輝生活超市。冬青樣本采集于北京市大興區(qū)舊宮鎮(zhèn)舊忠路街道,杜仲、紫葉桃、銀杏、滴水觀音、綠蘿樣本采集于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院院內(nèi)。所用細(xì)菌樣本為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、糞鏈球菌,均屬于實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.2.2 擴(kuò)增方法

細(xì)菌擴(kuò)增管家基因選擇16S rRNA[6],具體引物探針見表1。動物擴(kuò)增管家基因選擇動物線粒體16S rRNA[7]。植物擴(kuò)增管家基因選擇植物內(nèi)源性基因tRNA-leu[8],并根據(jù)20余種常見植物tRNA-leu序列(序列信息見表2),使用MEGA 7進(jìn)行多序列比對后自行設(shè)計得出最優(yōu)探針序列(表1)。

擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL,擴(kuò)增程序如下:95℃,9 min;95℃,15 s,60℃,60 s(40個循環(huán))。擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)對照組使用其余兩類生物核酸(比如:若驗(yàn)證細(xì)菌引物則對照組為動物、植物核酸樣本),陰性對照使用熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒內(nèi)提供的無菌無核酸酶水。

1.3 室外環(huán)境生物氣溶膠樣本分析

1.3.1 環(huán)境氣溶膠樣本的采集

本研究使用BIO Capturer-6病毒氣溶膠采集富集儀共采集環(huán)境氣溶膠樣本28份。采集地為中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院院內(nèi)(北緯 39°47′0′′,東經(jīng) 116°30′37′′),采樣點(diǎn)選取中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院主樓12層頂開放性天臺(距地平面高度60 m)和后院內(nèi)地平面,時間為2018年6月27日至7月3日共7 d,每天分上午和下午兩個時段進(jìn)行采樣。采樣時記錄溫濕度等天氣狀況,7 d內(nèi)采樣溫度跨度為24～39℃,相對濕度跨度為15%～82%。

采集氣溶膠樣本時,采樣瓶中加入采樣液PBS 50 mL,并加入150 μL磁珠。每個空氣樣本設(shè)定采樣量為1 000 L。采樣完成后將采樣瓶放到磁力架上,靜置吸附10 min,使磁珠充分被吸附于磁鐵處,倒掉上清,移走磁力架,加入500 μL PBS,使磁珠重懸,吸出至1.5 mL EP管中,放于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。采樣瓶不重?fù)使用,采樣噴頭旋下后用75%乙醇浸泡至少1 h,使用雙蒸水沖洗干凈,放入80℃烘箱中過夜干燥備用。

陰性對照樣本的采集:在實(shí)驗(yàn)室選擇一臺Ⅱ級生物安全柜,打開運(yùn)轉(zhuǎn)20 min后,將BIO Capturer-6采樣器放到安全柜操作臺面上,采集1 000 L無菌空氣樣本作為陰性對照。

表1 熒光定量PCR引物探針序列Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

表2 25種植物的tRNA-leu序列信息Table 2 tRNA-leu sequence information of 25 plants

1.3.2 環(huán)境氣溶膠樣本管家基因的檢測

使用DNeasy PowerWater Kit水樣DNA提取試劑盒提取樣本核酸,熒光定量PCR擴(kuò)增方法同步驟1.2.2。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計檢驗(yàn),兩組間正態(tài)分布計量資料的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,計量資料組間兩兩比較采用q檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析,以P＜0.05作為具有統(tǒng)計學(xué)差異的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 管家基因引物探針序列的特異性驗(yàn)證

2.1.1 細(xì)菌16S rRNA基因引物探針的通用性及特異性檢測

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、糞鏈球菌的DNA樣本作為實(shí)驗(yàn)組,并取部分動物(豬肉、雞肉)和植物(杜仲、銀杏)的 DNA樣本作為對照組,進(jìn)行熒光定量PCR檢測,結(jié)果如下:金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、糞鏈球菌樣本的 Ct值分別為 15.81、12.62、12.07、9.05;選用的杜仲、銀杏、豬肉、雞肉以及體系水對照樣本均無擴(kuò)增曲線。雖然多次重復(fù)結(jié)果的陽性Ct值有細(xì)微改變,但各物種擴(kuò)增結(jié)果相同。以上結(jié)果證明16S rRNA引物探針有良好的細(xì)菌源性檢測通用性及物種特異性。

2.1.2 動物線粒體16S rRNA基因引物探針的通用性及特異性驗(yàn)證

將提取的牛肉、豬肉、魚肉、雞肉DNA作為實(shí)驗(yàn)組,同時以部分植物(杜仲、銀杏)和細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)的DNA樣本作為對照組,進(jìn)行熒光定量PCR檢測,結(jié)果顯示:牛肉、豬肉、魚肉、雞肉樣本的 Ct值分別為 11.30、14.80、26.66、26.02;選用的杜仲、銀杏、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及體系水對照樣本均無擴(kuò)增曲線。雖然多次重復(fù)結(jié)果的陽性Ct值有細(xì)微改變,但各物種擴(kuò)增結(jié)果相同。以上結(jié)果證明動物線粒體16S rRNA引物探針有良好的動物源性檢測通用性及物種特異性。

2.1.3 植物tRNA-leu基因引物探針的通用性及特異性檢測

將杜仲、紫葉桃、冬青、銀杏、滴水觀音、油菜、萵苣、綠蘿的DNA樣本作為實(shí)驗(yàn)組,并取部分動物(雞肉、豬肉)和細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)的DNA樣本作為對照組,進(jìn)行熒光定量PCR檢測,結(jié)果如下:杜仲、紫葉桃、冬青、銀杏、滴水觀音、油菜、萵苣、綠蘿樣本的Ct值分別為19.00、13.85、24.55、22.13、15.45、12.88、11.64、12.93;選用的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞肉、豬肉以及體系水對照樣本均無擴(kuò)增曲線。雖然多次重復(fù)結(jié)果的陽性Ct值有細(xì)微改變,但各物種擴(kuò)增結(jié)果相同。以上信息證明tRNA-leu引物探針有良好的植物源性檢測通用性及物種特異性。

2.2 環(huán)境氣溶膠樣本的組分分析

使用3種管家基因引物探針對28份環(huán)境樣本進(jìn)行熒光定量PCR檢測,取PCR酶體系水為空白對照,安全柜內(nèi)采集的氣溶膠樣本為陰性對照,1.2章節(jié)選取的細(xì)菌、動物和植物中提取的核酸分別為相對應(yīng)的陽性對照。熒光擴(kuò)增曲線如圖1所示,具體Ct值見表3。結(jié)果表明,28份環(huán)境樣本均有細(xì)菌、動物和植物成分檢出,且有完整擴(kuò)增曲線;陰性對照、空白對照的檢測結(jié)果均為undetected。

圖1 環(huán)境氣溶膠樣本的管家基因檢測結(jié)果(A)細(xì)菌成分檢測結(jié)果;(B)動物成分檢測結(jié)果;(C)植物成分檢測結(jié)果。各圖中陰性對照及空白對照均無擴(kuò)增曲線,陽性對照擴(kuò)增曲線完好。Fig.1 Housekeeping gene detection of environmental aerosol sample(A)Bacterial component testing;(B)Animal component testing;(C)Plant component testing.Negative control and blank control in each figure have no amplification curve,and the positive control amplification curve is intact.

2.2.1 空氣樣本中細(xì)菌、動物和植物三者成分間的比較

對收集到的樣本中細(xì)菌、動物和植物成分的相對含量進(jìn)行分析(圖2)。結(jié)果表明,空氣中細(xì)菌、動物和植物來源的成分含量差異顯著(P=0.000＜0.05)。進(jìn)一步兩兩比較可知,采集到的氣溶膠中細(xì)菌、動物、植物三者成分的相對含量存在差異,細(xì)菌最多,植物次之,動物成分最少。

圖2 空氣氣溶膠中細(xì)菌、動物和植物成分的Ct值散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plot of Ct values of bacterial,animal and plant constituents in aerosols

2.2.2 高度對空氣樣本中細(xì)菌、動物和植物成分的影響

按照采樣時的高度將采集樣本分為12層天臺(高度60 m)和后院地面(高度0 m)兩組。結(jié)果表明不同高度的空氣中細(xì)菌、動物、植物的成分含量均無顯著性差異(細(xì)菌P=0.365＞0.05,動物P=0.904＞0.05,植物 P=0.847＞0.05,圖 3)。

2.2.3 溫度對空氣樣本中細(xì)菌、動物和植物成分的影響

在樣品采集的一周內(nèi),溫度變化范圍為24～39℃,不同溫度條件下的空氣樣本中細(xì)菌、動物、植物成分的Ct值如圖4所示。結(jié)果表明:不同溫度下,空氣中動物、植物的成分含量無顯著性差異(動物 P=0.45＞0.05,植物 P=0.963＞0.05);溫度與細(xì)菌Ct值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.434,P=0.021＜0.05),即溫度越高,細(xì)菌Ct值越低,采集到的細(xì)菌粒子越多。

2.2.4 濕度對空氣樣本中細(xì)菌、動物和植物成分的影響

在樣品采集的一周內(nèi),相對濕度變化范圍為15%～82%,不同濕度條件下的空氣樣本中細(xì)菌、動物、植物成分的Ct值如圖5所示。結(jié)果表明:不同濕度下,空氣中動物和植物成分的含量無顯著性差異(動物 P=0.463＞0.05,植物 P=0.956＞0.05);濕度與細(xì)菌Ct值呈正相關(guān)(r=0.660,P=0.000＜0.05),即濕度越低,細(xì)菌Ct值越低,采集到的細(xì)菌粒子越多。

表3 環(huán)境氣溶膠樣本管家基因檢測結(jié)果Table 3 Housekeeping gene detection results of environmental aerosol samples

圖3 不同采樣高度下各成分的Ct值Fig.3 Ct value of each component at different sampling heights

圖4 不同采樣溫度下各成分的Ct值Fig.4 Ct value of each component at different sampling temperatures

3 討論

生物氣溶膠的潛在危害性被越來越多的人重視,對生物氣溶膠的研究需要?dú)庀髮W(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物信息學(xué)等多個領(lǐng)域的技術(shù)[9～10]。眾所周知空氣微生物中的細(xì)菌如沙門氏菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌等感染會危害人類健康甚至生命[11],但空氣中存在的動植物源性成分對人類健康構(gòu)成的潛在危害往往被人忽略:植物花粉會引發(fā)敏感人群的過敏反應(yīng)[12];寄生蟲及蟲卵可引發(fā)人群傳染病[13];蚊蟲等生物是許多傳染病的傳播媒介[14]。目前對空氣中生物氣溶膠的研究主要針對細(xì)菌、真菌或病毒[15～18],缺少有效的手段對空氣中的各生物組分進(jìn)行成分監(jiān)測。管家基因是一類在所有細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的基因,憑借其這一特性,管家基因成為研究基因表達(dá)的重要內(nèi)參。管家基因常常作為分子標(biāo)記被用于物種鑒別和生物摻雜鑒定:楊永存等[19]使用同源異形盒基因鑒別食用油中是否混有動物源性地溝油成分;18S rRNA基因被用于檢測明膠中的牛羊等動物源性成分[20];岳巧云等[21]使用leu基因作為檢測奶粉中是否摻入大豆成分的分子標(biāo)記。

圖5 不同采樣濕度下各成分的Ct值Fig.5 Ct value of each component under different sampling humidities

本研究從生物管家基因角度出發(fā),借助自主研發(fā)的BIO Capturer-6病毒氣溶膠采集富集儀,建立了一種檢測生物氣溶膠樣本中動物、植物、細(xì)菌總成分相對含量的方法。通過對影響空氣中細(xì)菌、動物、植物成分采集的相關(guān)因素進(jìn)行分析,一方面得出溫度和濕度對細(xì)菌的采集均有影響,隨著溫度的升高或濕度的降低,氣溶膠樣本中細(xì)菌Ct值逐漸降低,這可能是由于當(dāng)溫度較高、濕度較小時,更有利于細(xì)菌在空中的懸浮,從而易于采集;另一方面,我們發(fā)現(xiàn)空氣氣溶膠中細(xì)菌、動物、植物三者成分的相對含量存在差異,即細(xì)菌最多,植物次之,動物最少,此結(jié)果可能與氣溶膠樣本中不同成分的粒徑大小有關(guān),BIO Capturer-6對細(xì)菌類的小粒徑顆粒的采集效率優(yōu)于對動植物類較大粒徑顆粒的采集效率。