游麗娟， 阮成旭， 袁重桂， 高俊暉， 丘英棟

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350108)

0 引言

鎘是植物非必需及有毒的元素， 并在環(huán)境中普遍存在. 隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展， 大量農(nóng)藥、 除草劑、 肥料施用于農(nóng)地， 使得水體重金屬污染程度愈發(fā)嚴(yán)重. 水體中過量的鎘元素， 不僅能在植物體內(nèi)殘留， 而且還會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生一系列的毒害作用， 造成生物量和體內(nèi)物質(zhì)代謝紊亂. 當(dāng)水體中重金屬含量超標(biāo)時(shí)， 不僅危及到水體中各種生物， 包括植物、 藻類、 微生物甚至是魚類， 受鎘污染的動(dòng)植物農(nóng)產(chǎn)品可通過食物鏈進(jìn)入到人體從而危及人類健康[1].

植物激素是植物體內(nèi)合成的對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化有著重要影響的微量有機(jī)質(zhì)， 能促進(jìn)細(xì)胞分裂、 生長(zhǎng)以及新器官的分化和形成， 對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化有重要影響. 甚至能減輕逆境條件下自由基活性氧對(duì)植物的傷害， 增強(qiáng)植物對(duì)嚴(yán)寒、 干旱、 高溫、 過量重金屬等非生物脅迫的適應(yīng)性， 主要有生長(zhǎng)素、 赤霉素、 細(xì)胞分裂素、 乙烯和脫落酸等5大類. 脫落酸(abscisic acid, ABA)是一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)， 在植物抵御干旱、 鹽害、 水澇、 冷害、 病害等方面起著重要的作用， 被稱為“逆境激素”. ABA 可促進(jìn)氣孔關(guān)閉、 誘導(dǎo)抗性蛋白的合成、 調(diào)控基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)[2].

外施ABA能夠提高小麥幼苗對(duì)鎘的耐性， 提高小麥幼苗的根系活力， 增加其葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、 過氧化氫酶(catalase, CAT) 和過氧化物酶(peroxidase, POD) 活性， 促進(jìn)其脯氨酸積累， 降低丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 的含量[3]. 而且外源ABA也能夠提高大麥幼苗對(duì)鎘的耐性， 并能明顯降低不結(jié)球白菜和水稻[4]幼苗地上部分的鎘含量. 因此， ABA可以提高植物對(duì)鎘脅迫的耐性， 并緩解鎘的毒害作用.

青萍(LemnaminorL.)， 別名為浮萍， 是一種水生維管束植物， 生于沼池、 湖泊或靜水中， 分布廣泛， 遍及全球溫暖的地區(qū). 青萍具有繁殖快、 產(chǎn)量高、 個(gè)體小、 直接浮于水面、 易從污染水體快速富集重金屬等優(yōu)點(diǎn)[5]， 經(jīng)常被用于水體生物監(jiān)測(cè)和植物修復(fù), 是植物修復(fù)技術(shù)的理想材料. 而且青萍的淀粉含量也很高， 可用于生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料乙醇[6]. 通過對(duì)文獻(xiàn)的考量， 外施ABA緩解植物鎘脅迫的機(jī)制研究大部分集中于陸生植物， 如水稻、 繁縷、 大麥等， 對(duì)水生漂浮植物報(bào)道較少. 本研究以青萍為材料， 探討外施ABA對(duì)鎘污染下青萍的生長(zhǎng)及生理生化指標(biāo)的影響， 為青萍嘗試作為重金屬鎘的富集植物， 從而應(yīng)用于鎘污染水體的修復(fù)及緩解重金屬對(duì)植物的毒害作用提供基礎(chǔ)理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年12月至2018年1月在福州大學(xué)應(yīng)用生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行. 試驗(yàn)用青萍采自生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 未經(jīng)重金屬污染， 采回后以自來水、 蒸餾水、 去離子水各沖洗數(shù)遍. 在實(shí)驗(yàn)室自然光照、 溫度為(20±2)℃下先用去離子水培養(yǎng)3 d， 再用Hoagland營養(yǎng)液[7]馴化培養(yǎng)3 d. 于實(shí)驗(yàn)前取外形完好、 顏色一致、 形狀和大小都相近的青萍進(jìn)行試驗(yàn).

1.2 試驗(yàn)方法

表1 處理方案

將選取的青萍移至生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)， 在可控溫條件(晝/夜(22/19±1)℃)下進(jìn)行外源物質(zhì)ABA及鎘脅迫處理. 試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理， 分別為: CK空白組， 培養(yǎng)于培養(yǎng)液中； Cd、 A1、 A2、 A3、 A4、 A5處理組， 具體處理方案如表1所示. ABA處理為鎘脅迫第二天進(jìn)行且采用傍晚葉面噴施的方式， 每次均噴施10 mL， 對(duì)照組和空白組均噴施蒸餾水. 每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行， 每盆營養(yǎng)液500 mL， 青萍投放量為2.00 g， 均置于直徑為15 cm的聚乙烯盆中培養(yǎng). 每次噴施以葉片均勻附著一層小水滴為準(zhǔn)， 各處理的光照條件一致， 均為溫室自然光照. 連續(xù)處理5 d后收取全部青萍， 測(cè)定相關(guān)指標(biāo)， 各生長(zhǎng)指標(biāo)及生理指標(biāo)測(cè)定重復(fù)3 次.

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

1) 鮮重的測(cè)定. 處理5 d后， 收取全部青萍， 先用自來水沖洗， 再用蒸餾水沖洗3遍， 瀝干水分， 平鋪在吸水紙上， 吸水5 min后電子天平稱重.

2) 質(zhì)量相對(duì)增加率和特定生長(zhǎng)率的計(jì)算. 質(zhì)量相對(duì)增加率的計(jì)算公式為

特定生長(zhǎng)率的計(jì)算公式為

式中： WGR和SGR分別為質(zhì)量相對(duì)增加率(%)和特定生長(zhǎng)率(%·d-1)；m1為初始平均質(zhì)量(g)；m2為終末平均質(zhì)量(g)；t2-t1為試驗(yàn)天數(shù)(d).

3) 光合色素含量的測(cè)定. 采用95%乙醇提取法[8]， 利用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)665、 649、 470 nm下測(cè)量其消光度.

4) 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和膜脂過氧化的測(cè)定. 可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮硫酸比色法； 脯氨酸含量的測(cè)定采用磺基水楊酸比色法, 具體參照文獻(xiàn)[9]. 可溶性蛋白含量的測(cè)定采用Bradford法[10]. 膜脂過氧化以MDA為指標(biāo)， 測(cè)定方法采用硫代巴比妥酸顯色法[11].

5) 抗氧化酶活性的測(cè)定. SOD和CAT活性的測(cè)定均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒， 貨號(hào)分別為SOD-2-Y和CAT-2-Y. POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[12].

1.4 數(shù)據(jù)處理.

采用Excel 2007計(jì)算實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖， SPSS Statistics 22軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan多重比較分析， 差異顯著水平設(shè)置為P<0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍的生長(zhǎng)影響結(jié)果見表2. 與CK相比， 鎘能顯著抑制青萍的生長(zhǎng)， 鮮重、 質(zhì)量相對(duì)增加率、 特定生長(zhǎng)率分別顯著減少了12.46%、 38.36%、 33.55%(P<0.05). 噴施ABA后， 以上生長(zhǎng)指標(biāo)均顯著增加(P<0.05), 隨ABA質(zhì)量濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)， 且在A3處理下達(dá)到最大值， 較鎘脅迫最大分別增加了5.38%、 23.90%、 20.84%. 由此說明在一定ABA質(zhì)量濃度下， 可以緩解青萍在鎘脅迫下的生長(zhǎng)狀況， 且ABA的質(zhì)量濃度對(duì)青萍生長(zhǎng)存在“低促高抑”的現(xiàn)象.

表2 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍鮮重、 質(zhì)量相對(duì)增加率、 特定生長(zhǎng)速率的影響

注： 表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差； 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同處理之間存在顯著差異(n=3)， 下同

2.2 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍光合色素含量的影響

不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍光合色素含量的影響見表3. 由表3可知， 鎘處理可能抑制了青萍色素的合成， 也可能加速了其分解， 使得青萍的葉綠素a、 葉綠素b、 葉綠素(a+b)和類胡蘿卜素含量顯著下降(P<0.05)， 進(jìn)而影響光合作用的順利進(jìn)行. 與CK相比， 鎘脅迫下青萍的葉綠素a、 葉綠素b、 葉綠素(a+b)和類胡蘿卜素含量分別顯著減少了33.84%、 25.00%、 32.94%和25.00%(P<0.05). 施加ABA后， 且隨ABA噴施質(zhì)量濃度的增加， 青萍的葉綠素a、 葉綠素b、 葉綠素(a+b)和類胡蘿卜素含量呈先上升后下降的趨勢(shì). 葉綠素a、 葉綠素b、 葉綠素(a+b)和類胡蘿卜素含量在A3處理下達(dá)到最大值， 比鎘脅迫分別提高了18.60%、 13.33%、 10.53%和41.67%. 由此可知， 外施ABA可提高光合色素含量來緩解鎘脅迫下青萍的光合作用， 且ABA的質(zhì)量濃度對(duì)色素含量影響存在“低促高抑”的現(xiàn)象， 這與ABA對(duì)鎘脅迫下青萍的生長(zhǎng)影響變化一致.

表3 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍色素含量的影響

2.3 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響見表4. 表4表明， 鎘脅迫下青萍的可溶性蛋白含量有所上升， 相比CK組顯著提高了0.65%(P<0.05). 施加外源ABA后， 各處理的蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)， 但變化較為平緩， 說明ABA能促進(jìn)鎘脅迫下青萍可溶性蛋白的表達(dá)(或減緩其分解). ABA各處理?xiàng)l件下青萍可溶性糖和脯氨酸含量均高于對(duì)照組， 鎘脅迫下青萍的可溶性糖含量急劇增加， 與CK相比， 顯著提高了64.74%(P<0.05)； 隨著外源ABA質(zhì)量濃度的升高， 各處理可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)， 在A4處理下達(dá)到最大值， 相比Cd 組增加了11.50%. 鎘脅迫下青萍的脯氨酸含量略微增加， 與CK組相比， 增加率為8.11%； 施加ABA后， 各處理組脯氨酸含量先增加后下降， 與生長(zhǎng)指標(biāo)、 光合色素含量、 可溶性蛋白和可溶性糖含量變化趨勢(shì)類似， 其中A3處理下脯氨酸含量達(dá)到最大值， 相比鎘脅迫下增加了10.00%. 表明鎘脅迫可以誘導(dǎo)青萍滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量上升， 施加一定質(zhì)量濃度ABA后會(huì)進(jìn)一步提高其含量， 且可以回到甚至超出CK水平， 而質(zhì)量濃度過高則會(huì)減少其含量， 同樣表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象.

表4 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.4 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍抗氧化酶活性和MDA含量的影響

不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍抗氧化酶活性和MDA含量的影響如圖1所示. 與CK相比， Cd顯著抑制了SOD活性， 顯著降低了14.53%(P<0.05)； 外施ABA后， SOD活性隨著ABA質(zhì)量濃度的升高先上升后下降， 且各處理下SOD活性仍顯著高于Cd組(P<0.05)， 在A1～A3處理下均超出CK水平， 最大可提高33.06%. 鎘脅迫下青萍的POD和CAT活性均顯著高于CK(P<0.05)， 分別提高了31.04%和5.06%， 施加外源ABA后， 隨著質(zhì)量濃度的增加， CAT活性先上升后下降， 在A3處理下， CAT活性達(dá)到峰值且顯著超出CK水平(P<0.05), 與CK和Cd組相比， 分別提高了16.88%和11.25%. 而POD卻有所不同， 隨ABA質(zhì)量濃度的增大， 其活性先下降后上升， 外源ABA雖然降低了青萍POD活性， 但各處理仍高于CK處理. 鎘脅迫下青萍的MDA含量顯著增加了12.33%(P<0.05)； 施加ABA后， 隨著ABA質(zhì)量濃度的增大， MDA含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)， 在A5處理下達(dá)到最大， A3處理下達(dá)到最小， 且顯著低于Cd組(P<0.05)， 說明高質(zhì)量濃度的ABA很可能加劇了鎘對(duì)青萍的毒害作用， 而低質(zhì)量濃度ABA可以抑制MDA含量的增加從而對(duì)青萍的膜脂過氧化反應(yīng)起到一定緩解作用.

注：同圖不同小寫字母表示不同處理之間存在顯著差異(n=3)圖1 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍抗氧化酶活性及MDA含量的影響Fig.1 Effects of different mass concentrations ABA on autioxidant enzyme activities and MDA content of Lemna minor under Cd stress

3 討論

3.1 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

已有研究表明， 外源ABA可以誘導(dǎo)植物非生物脅迫耐受性， 能改善鎘脅迫下植物的生長(zhǎng)、 光合作用、 抗氧化酶活性等， 從而在一定程度上緩解鎘的毒害作用， 促進(jìn)植物生長(zhǎng). 重金屬脅迫下植物體最先表現(xiàn)出的一個(gè)重要特征就是生物量減小， 植物受到鎘毒害后， 特別是根部受到毒害時(shí)， 會(huì)嚴(yán)重影響到根部水分和礦質(zhì)元素的吸收， 從而影響整個(gè)植物的生長(zhǎng)， 導(dǎo)致生物量下降[13]. 在本試驗(yàn)中， 當(dāng)培養(yǎng)液中存在CdCl2時(shí)， 青萍的鮮重、 質(zhì)量相對(duì)增加率和特定生長(zhǎng)率顯著下降(P<0.05)； 外施ABA后， 青萍的鮮重、 質(zhì)量相對(duì)增加率和特定生長(zhǎng)率得到顯著提高(P<0.05)， 說明外施一定質(zhì)量濃度的ABA可以緩解鎘對(duì)青萍生長(zhǎng)的毒害作用， 這與孫仲秧[14]研究的外源脫落酸緩解水稻鎘毒害的生理機(jī)制結(jié)論相同.

3.2 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍光合色素含量的影響

鎘會(huì)降低植物的光合色素含量從而影響植物的光合作用， 其機(jī)理主要是因?yàn)殒k會(huì)影響植物的水分吸收從而影響植物的水分平衡， 在一定程度上會(huì)抑制葉綠素生物合成的關(guān)鍵性酶的活性， 使葉綠體光合膜蛋白中心離子發(fā)生改變， 導(dǎo)致葉綠素含量降低， 破壞光合器官及色素繼而破壞光合作用過程， 如類囊體膜上的電子傳遞鏈， 碳循環(huán)和氣孔運(yùn)動(dòng)， 從而導(dǎo)致光合效率下降， 影響植物正常生長(zhǎng). 本研究結(jié)果表明， 在鎘的脅迫下， 青萍的葉綠素a、 葉綠素b、 葉綠素(a+b)、 類胡蘿卜素均顯著下降， 分別減少了33.84%、 25.00%、 32.94%和25.00%(P<0.05)， 在很大程度上顯著抑制了光合作用效率. 在鎘脅迫下外施ABA后， 各處理的光合色素含量隨著ABA質(zhì)量濃度的增大均有提高， 尤其是類胡蘿卜素， 在A3處理下， 含量已超過CK水平， 相比鎘提高41.67%， 由此說明外源ABA可促進(jìn)光合色素的合成(或減緩其分解)， 從而促進(jìn)光合作用， 提高光合作用效率. 譚華強(qiáng)等[15]在外施ABA對(duì)鎘脅迫下萵苣的研究中發(fā)現(xiàn)， 與Cd組相比， ABA處理可使生菜的葉綠素a、 葉綠素b、 類胡蘿卜素、 葉綠素總含量均有所提高， 這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致. ABA對(duì)鎘脅迫下的緩解作用主要?dú)w結(jié)于ABA受體之ChlH/ABAR， ChlH/ABAR是位于植物細(xì)胞質(zhì)體/葉綠體中的鎂離子螯合酶H 亞基， 它能催化細(xì)胞葉綠素的合成， 從而控制葉片的光合作用和植物生長(zhǎng).

3.3 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

當(dāng)重金屬離子進(jìn)入植物組織時(shí)， 植物會(huì)通過增加可溶性蛋白、 可溶性糖及脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來維持體內(nèi)的水分平衡, 維持壓力勢(shì)基本不變以保證植物體內(nèi)生理生化過程的正常進(jìn)行, 從而提高對(duì)重金屬脅迫的抗性. 本研究中， 鎘脅迫導(dǎo)致青萍的可溶性蛋白、 可溶性糖和脯氨酸含量增加； 外施ABA后， 各處理的可溶性蛋白、 可溶性糖和脯氨酸含量隨ABA質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì). 在A2或A3處理下， 這3種物質(zhì)含量均達(dá)到峰值， 且均超出CK水平， 說明ABA可以誘導(dǎo)植物積累更多的可溶性蛋白、 可溶性糖和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵抗鎘的毒害作用. 這是因?yàn)樵阪k脅迫下， 外源ABA不僅能在轉(zhuǎn)錄水平上激活一些逆境基因的表達(dá)、 促進(jìn)逆境蛋白的合成， 還能誘導(dǎo)PCS1基因轉(zhuǎn)錄水平和提高植物螯合肽合成酶PCS活性， 從而促進(jìn)植物螯合肽大量合成并螯合重金屬離子發(fā)揮解毒作用[16]. 而脯氨酸可與重金屬離子結(jié)合， 形成無毒的Cd-脯氨酸復(fù)合物， 該復(fù)合物可以減少重金屬離子對(duì)一些酶活性中心的傷害， 從而緩解鎘對(duì)青萍的毒害作用.

3.4 不同質(zhì)量濃度ABA對(duì)鎘脅迫下青萍抗氧化酶活性和MDA含量的影響

4 結(jié)語

鎘會(huì)影響青萍的生長(zhǎng)、 光合色素含量、 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶系統(tǒng)， 從而對(duì)青萍產(chǎn)生毒害作用. ABA的存在促進(jìn)了光合作用的進(jìn)行和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累， 減少了自由基對(duì)膜的破壞， 可以延緩SOD、 CAT活性的下降， 降低MDA的積累， 緩解了膜脂過氧化反應(yīng)， 使質(zhì)膜受到保護(hù)， 從而來減輕鎘對(duì)青萍的傷害. 研究表明， 外施ABA質(zhì)量濃度為1×10-3mg·L-1或1×10-4mg·L-1時(shí)效果最好.