孫夢瑤，王丹丹，吳秋雪，倪振華，湯慶豐＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院 上海 200062；2.上海中醫(yī)藥大學交叉科學研究院 上海 201203）

胃癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均較高，據(jù)統(tǒng)計，全球每年胃癌死亡病例約為70萬例，在惡性腫瘤中高居第2位[1]。胃癌目前總體治療效果不理想，5年生存率低于30%[2]。手術(shù)切除是治療胃癌的首選方法，但手術(shù)切除僅適用于胃癌早期患者。由于胃癌起病隱匿，很多患者確診時已經(jīng)處于晚期。化療是當前臨床治療腫瘤的重要手段。然而，長期化療出現(xiàn)的腫瘤多藥耐藥（multidrug resistant，MDR）嚴重影響了胃癌治療效果[3]。因此，探索新的逆轉(zhuǎn)化療耐藥、提高化療藥物敏感性的藥物具有重要意義。

腫瘤多藥耐藥是多種基因調(diào)控、多種途徑聯(lián)合作用的網(wǎng)絡(luò)化調(diào)節(jié)的結(jié)果。腫瘤細胞可通過不同途徑導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生，且單個MDR細胞也可同時存在多種耐藥性的機制[4]?，F(xiàn)有的針對特定靶點的經(jīng)典的化學逆轉(zhuǎn)劑如P-gp抑制劑奎尼丁等在與抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥時通常會產(chǎn)生嚴重的副作用，限制了其臨床應(yīng)用[5]。隨著中藥抗腫瘤研究的發(fā)展，傳統(tǒng)中藥提取物和中藥單體作為MDR的逆轉(zhuǎn)劑得到了廣泛關(guān)注。中藥提取物和中藥單體不僅既有多靶點的特性使其具備抗腫瘤活性又兼具逆轉(zhuǎn)耐藥作用，還具有低毒的獨特優(yōu)勢，從而為MDR提供了新的治療途徑[6]。例如人參皂苷Rg3是從我國傳統(tǒng)中藥人參中提取的單一成分，對結(jié)腸癌、肝癌多種惡性腫瘤均具有顯著抑制作用。人參皂苷Rg3不僅具有顯著的抗癌效果[7,8]，還可與常規(guī)的治療方式聯(lián)用起到增效減毒，逆轉(zhuǎn)化療耐藥和提高患者免疫力等作用[9,10]。Zhi Zhen Fang提取物可抑制Hedgehog信號通路逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌化療耐藥[11]。

左金丸是中醫(yī)經(jīng)典方劑，出自元代著名醫(yī)家朱丹溪《丹溪心法·火方》，方中黃連六兩、吳茱萸一兩，常用于胃部疾病[12]。現(xiàn)代藥理研究表明，左金丸具有抑制胃癌細胞增殖、誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡等作用[13-15]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)左金丸可通過調(diào)節(jié)Cofilin-1的線粒體轉(zhuǎn)位增加胃癌順鉑耐藥細胞對DDP的敏感性[15]。然而，盡管左金丸對胃癌順鉑耐藥具有明顯的抑制作用，但其目前存在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機制不明確的情況，限制了左金丸在臨床胃癌治療中的廣泛應(yīng)用。很多研究表明黃連和吳茱萸中所含的吳茱萸堿與小檗堿具有多種抗腫瘤作用，包括抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、減少腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移等[16-18]。聯(lián)合使用這兩種成分在胃癌中有明顯的協(xié)同抗腫瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移的效果[19]。不僅如此，吳茱萸堿、小檗堿可通過誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species,ROS）、促進凋亡對多種人類腫瘤細胞具有放化療增敏作用[20,21]。然而，吳茱萸堿、小檗堿對胃癌順鉑耐藥的抑制作用尚不清楚。因此，本文旨在探討吳茱萸堿和小檗堿單用及合用對胃癌耐藥細胞DDP敏感性的影響及其可能的機制，以期為臨床胃癌的防治提供一定的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

吳茱萸堿、小檗堿（成都瑞芬思生物科技有限公司）；DDP（美國Sigma公司）；DMSO（美國Sigma公司）；RPMI 1640（美國Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司）；青鏈霉素（美國Invitrogen公司）；Trypsogen-EDTA（0.25%）（美國Invitrogen公司）；磷酸緩沖鹽溶液PBS（美國Hyclone公司）；細胞凍存液（美國Invitrogen公司）；CCK-8（日本同仁公司）；RIPA組織細胞快速裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；蛋白預(yù)染Marker（加拿大Fermentas公司）；Anti-P-gp（ab103477）、MRP（ab24102）、Caspase-3（ab13847）、Caspase-9（ab52298）（英 國Abcam公司）；Anti-GAPDH（5174）（美國CST公司）。羊抗兔HRP標記二抗、羊抗小鼠HRP標記二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；ECL發(fā)光液（美國Millipore公司）。

1.2 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；生物安全柜（Haier公司）；倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）；離心機（德國Eppendorf公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）；電子天平（Sartorius公司）；酶標儀（美國Bio-rad公司）；制冰機（美國Thermo公司）；電泳儀（美國Biorad公司）；電泳槽（美國Bio-rad公司）；轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-rad公司）；Western blotting成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

采用逐步遞增DDP濃度的方法誘導(dǎo)人胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP。細胞所用培養(yǎng)基為90%RPMI 1640、10%FBS、1%雙抗和800 ng·mL-1DDP。細胞于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每日觀察細胞生長情況，取生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.3.2 藥物處理

吳茱萸堿、小檗堿，DMSO配制儲備液，混合均勻后，過濾器過濾。給予藥物處理時，用細胞培養(yǎng)基將藥物儲備液稀釋成所需濃度。

1.3.3 CCK-8實驗

將處于對數(shù)生長期的細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，顯微鏡下計數(shù)后以5×104個·mL-1的細胞密度鋪于96孔細胞培養(yǎng)板。實驗分為對照組、DDP組、吳茱萸堿+DDP組、小檗堿+DDP組及吳茱萸堿+小檗堿+DDP組。每組設(shè)置6個平行孔，以100 L培養(yǎng)液做空白對照，37℃培養(yǎng)過夜。CCK-8實驗檢測開始時，按1∶10體積比混合CCK-8和無血清培養(yǎng)基RPMI-1640，在每待測孔中加入100 L，繼續(xù)在37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-2 h。在酶標儀450 nm波長處測定各孔吸光值（OD值），并記錄每塊板的數(shù)值。

1.3.4 Western blot

將需要抽提蛋白的細胞用適量預(yù)冷的1×PBS洗滌2次后，加入蛋白裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），4℃下充分裂解細胞，然后將細胞刮入離心管中，12000 rpm離心10分鐘，取上清，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。各蛋白樣品加入適量上樣緩沖液，95℃以上加熱10分鐘進行蛋白變性，貯存于-20℃或-80℃冰箱。根據(jù)目的蛋白的分子量選擇下層分離膠。P-gp蛋白分子量為170 kDa，MRP蛋白分子量為190 kDa，caspase-3蛋白分子量為34 kDa，caspase-9蛋白分子量為46 kDa，GAPDH蛋白分子量37 kDa，故選用8%和10%的凝膠。將準備好的蛋白樣品依次上樣，每孔上樣量20 g。電泳至目的蛋白可以區(qū)分即停止電泳。轉(zhuǎn)膜及封閉后，孵育一抗（根據(jù)說明書稀釋抗體），4℃下孵育過夜后，TBST洗脫三次，10 min·次-1。室溫條件下孵育HRP標記的二抗（根據(jù)說明書稀釋抗體）1-2小時，TBST洗脫三次，10 min·次-1。取適量ECL發(fā)光液顯色，掃膜。

圖1 吳茱萸堿、小檗堿對SGC-7901/DDP細胞活力的影響

圖2 吳茱萸堿、小檗堿增加SGC-7901/DDP對DDP的敏感性

1.3.5 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗比較兩組間的差異，方差分析（ANOVA）進行多組間的比較。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學差異。采用GraphPad Prism 5.01軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸堿、小檗堿對SGC-7901/DDP細胞活力的影響

培養(yǎng)的SGC7901/DDP細胞接種于96孔板后，分別經(jīng)不同濃度的吳茱萸堿（0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2 M）或小檗堿（0,0.25,0.5,1,2,4,8,16 M）處理，每組為6個復(fù)孔，處理時間為12 h,24 h和48 h。如圖1A、B所示，CCK8實驗檢測SGC-7901/DDP細胞活力變化表明吳茱萸堿、小檗堿對SGC-7901/DDP細胞活力的抑制作用呈現(xiàn)時間-和劑量-依賴性。當藥物處理時間為24 h、48 h，小檗堿組（8 M）及吳茱萸堿組（3.2 M）與對照組（0 M）相比，細胞抑制率低于5%。

2.2 吳茱萸堿、小檗堿增加SGC-7901/DDP對DDP的敏感性

選擇對SGC7901/DDP細胞增殖沒有顯著抑制（抑制率低于5%的濃度）的吳茱萸堿（3.2 M）及小檗堿（8 M）濃度分別與順鉑（0,0.5,1,2 g·mL-1）共同孵育SGC7901/DDP細胞24 h或48 h，CCK8檢測結(jié)果顯示，吳茱萸堿（EVO）處理24 h后，DDP對耐藥細胞株SGC7901/DDP的半數(shù)抑制濃度（IC50）由7.45 g·mL-1變?yōu)?.364 g·mL-1，EVO處理48 h后，DDP對耐藥細胞株 SGC7901/DDP 的 IC50（ g·mL-1）由 7.041 變?yōu)?.389。小檗堿（BER）處理24 h后，DDP對耐藥細胞株SGC7901/DDP的IC50（ g·mL-1）由7.45變?yōu)?.416，BER處理48 h后，DDP對耐藥細胞株SGC7901/DDP的IC50（ g·mL-1）由7.041變?yōu)?.862。BER和EVO聯(lián)合處理24h后，DDP對耐藥細胞株SGC7901/DDP的IC50（ g·mL-1）由7.45變?yōu)?.065,48 h后DDP對耐藥細胞株SGC7901/DDP的IC50（ g·mL-1）由7.041變?yōu)?.515（圖2，表1，表2）。以上結(jié)果表明吳茱萸堿、小檗堿單用或聯(lián)合使用可增加人胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP對DDP的敏感性，吳茱萸堿和小檗堿合用增加SGC-7901/DDP對DDP的敏感性的效果顯著優(yōu)于二者單獨使用。

表1 處理24 h各組細胞抑制率比較（Mean±SD，n=6）

表2 處理48 h各組細胞抑制率比較（Mean±SD，n=6）

2.3 吳茱萸堿、小檗堿對SGC-7901/DDP耐藥及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

吳茱萸堿（3.2 M）和小檗堿（8 M）分別與1 g·mL-1濃度的順鉑共同孵育SGC-7901/DDP細胞48 h，Western blot檢測各組P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、MDR 相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）、caspase-3、caspase-9的表達。相比于Control組，DDP組P-gp、MRP蛋白的表達顯著升高(圖3)。而加入?yún)擒镙菈A或小檗堿則可顯著抑制DDP誘導(dǎo)的P-gp、MRP蛋白表達升高，并提高caspase-3、caspase-9的蛋白表達。DDP+EVO+BER組P-gp、MRP蛋白的表達顯著低于DDP+EVO（P＜0.001）和DDP+BER組（P＜0.001），DDP+EVO+BER組caspase-3、caspase-9蛋白的表達明顯高于DDP+EVO（P＜0.001）和DDP+BER組（P＜0.001）。

3 討論

吳茱萸堿是來源于中藥吳茱萸的天然生物堿，具有多種生物學和藥理學效應(yīng)。吳茱萸堿可誘導(dǎo)SGC7901細胞周期G2/M期阻滯、促進凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9的表達[22]。Hu等[23]發(fā)現(xiàn)口服吳茱萸堿能顯著減小肝癌荷瘤小鼠腫瘤的大小。這一過程與吳茱萸堿激活WW結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶相關(guān)。吳茱萸堿還可通過下調(diào)MMP-9、尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）和uPAR的表達抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵襲[24]。更值得關(guān)注的是，吳茱萸堿對多種化療耐藥的腫瘤細胞有顯著的抑制作用，吳茱萸堿聯(lián)合化療藥物可極大地增強抗腫瘤作用。有研究[25]表明吳茱萸堿通過誘導(dǎo)G2/M期細胞周期阻滯，抑制人上皮性卵巢癌細胞和耐藥性人上皮性卵巢癌細胞增殖，此外，吳茱萸堿抑制耐藥卵巢癌細胞P-gp蛋白的表達和功能從而改善卵巢癌細胞化療耐藥性。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿還可調(diào)節(jié)NF-κB磷酸化及藥物外排功能，增強奧沙利鉑、長春新堿、順鉑和5-氟尿嘧啶的抗腫瘤細胞增殖活性，在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的化療抵抗[26]。

圖3 各處理組P-gp、MRP、caspase-3、caspase-9蛋白的表達

小檗堿是一種植物來源的異喹啉類生物堿，由于其低毒性和抗癌特性，小檗堿具有作為化療佐劑的潛力[27]。大量研究表明小檗堿可通過誘導(dǎo)caspase家族蛋白引起腫瘤細胞凋亡的發(fā)生，可上調(diào)p53蛋白阻滯腫瘤細胞周期，從而抑制腫瘤細胞增殖[28]。此外，小檗堿與長春新堿、伊立替康、順鉑等化療藥物聯(lián)合用藥在腫瘤治療過程中可起到協(xié)同作用[29,30]。小檗堿聯(lián)合順鉑孵育的卵巢癌耐藥細胞A2780/DDP的存活率顯著低于對照組。小檗堿通過上調(diào)miR-93的表達從而激活/PTEN/Akt信號通路，增強順鉑誘導(dǎo)的A2780/DDP細胞凋亡[31]。小檗堿還可抑制NF-κB活化增強5-氟尿嘧啶（5-FU）、阿霉素及CPT-11誘導(dǎo)的細胞凋亡[29,32]，從而增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。You等[33]發(fā)現(xiàn)施加小檗堿可激活SGC-7901/DDP細胞中miR-203/Bcl-w凋亡信號通路，增強胃癌順鉑耐藥細胞對DDP的敏感性。

DDP是臨床治療胃癌的一線化療藥物，然而胃癌化療DDP耐藥是胃癌治療過程中的重大挑戰(zhàn)。在本項研究中我們發(fā)現(xiàn)低濃度的吳茱萸堿、小檗堿在不抑制胃癌耐藥細胞增殖的情況下（抑制率低于5%）可誘導(dǎo)SGC-7901/DDP對DDP的敏感性，與前期研究結(jié)果一致[33]。相對于小檗堿、吳茱萸堿單獨使用，本研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿、小檗堿聯(lián)合使用抑制SGC-7901/DDP鉑耐藥效果更佳。這也提示我們，基于中藥單體化合物相互協(xié)調(diào)、互補或制約等效應(yīng)，中藥單體的協(xié)同使用相比于現(xiàn)行的單體制劑具有其獨特的優(yōu)勢。因此，中藥單體的配伍模式在腫瘤治療方面具有較好前景。

目前關(guān)于腫瘤化療耐藥的機制研究假說主要包括藥物外排增加及代謝異常，增加DNA損傷修復(fù)及減少細胞凋亡，缺氧及缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α），上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化等[34]。P-gp是ATP結(jié)合性盒型轉(zhuǎn)運蛋白超家族（ATP-binding cassettetransporterssuperfamily，ABC轉(zhuǎn)運體）蛋白，由多藥耐藥基因（MDR）編碼。P-gp具有能量依賴性“藥泵”功能，單一藥物的長期治療可激活細胞膜P-gp的功能，將藥物從脂質(zhì)雙分子層轉(zhuǎn)運到細胞外，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥[35]。MRP是多藥MDR形成機制之一，屬于ABC轉(zhuǎn)運體蛋白，主要通過介導(dǎo)抗癌藥物在細胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運而形成耐藥[36]。有文獻報道，在人體胃癌組織的耐藥組織中P-gp和MRP的陽性率明顯高于藥物敏感的組織，提示P-gp和MRP與胃癌的多藥耐藥相關(guān)[37]。因此本研究采用Western blot檢測了吳茱萸堿和小檗堿對胃癌耐藥細胞P-gp、MRP表達的影響。我們發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿和小檗堿可顯著抑制DDP誘導(dǎo)的P-gp、MRP蛋白表達升高。且DDP+EVO+BER組P-gp、MRP蛋白的表達顯著低于DDP+EVO（P＜0.001）或DDP+BER組（P＜0.001）。這表明吳茱萸堿和小檗堿抑制P-gp、MRP蛋白的表達是其逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細胞化療耐藥的機制之一。除此之外，腫瘤細胞對凋亡的耐受也是MDR的重要機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于DDP組，DDP+BER組和DDP+EVO組凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9表達顯著增加，且吳茱萸堿和小檗堿聯(lián)合使用下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9的效果優(yōu)于單獨使用。

綜上所述，吳茱萸堿、小檗堿可作為中藥化療耐藥逆轉(zhuǎn)劑應(yīng)用于胃癌化療輔助治療，其作用靶點廣，可通過多個靶點增強胃癌耐藥細胞對順鉑的敏感性，逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥。此外，吳茱萸堿、小檗堿本身也具備抑制胃癌耐藥細胞生長的作用，因此，其與化療藥物共同使用能更有效抑制腫瘤細胞的增殖。和以往逆轉(zhuǎn)劑相比，吳茱萸堿、小檗堿作為天然產(chǎn)物，具有高效、低毒、作用靶點廣泛的優(yōu)勢，且吳茱萸堿、小檗堿在胃癌順鉑耐藥中起到協(xié)同抑制作用，這為治療胃癌化療耐藥提供新的研究方向。但本研究中吳茱萸堿、小檗堿增加胃癌耐藥細胞化療敏感性的作用機制研究仍不深入，吳茱萸堿、小檗堿是否通過調(diào)節(jié)miRNA的表達影響耐藥相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達，這一作用是否涉及其它耐藥機制如PI3K/Akt信號通路有待進一步研究。本研究僅限于細胞水平的觀察，在體內(nèi)小檗堿、吳茱萸堿是否均能提高胃癌耐藥細胞對DDP的敏感性的研究有待進一步開展。