裴亞妮，楊 光，張 磊，高譽(yù)珊，張淑靜，馮思凝，周英奕，張學(xué)婷，薛衛(wèi)國(guó)＊＊

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029)

1 前言

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種以認(rèn)知功能障礙為特征的漸進(jìn)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征被認(rèn)為是神經(jīng)元外β淀粉樣蛋白（β-Amyloid，Aβ）沉積形成的老年斑（senile plaques，SP）和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）。目前研究顯示，自噬功能障礙與AD的病理進(jìn)程息息相關(guān)[1]。自噬（autophagy）是真核細(xì)胞內(nèi)異常蛋白和受損細(xì)胞器被降解的重要生物學(xué)過(guò)程，一般經(jīng)歷自噬啟動(dòng)、自噬體形成、自噬體與溶酶體融合、蛋白降解4個(gè)階段，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。而神經(jīng)元這類(lèi)有絲分裂細(xì)胞不能通過(guò)細(xì)胞分裂有效地稀釋原本細(xì)胞中累積的有毒碎片和受損細(xì)胞器，因此這一作用在神經(jīng)元中顯得更為重要[2]。

AD腦內(nèi)自噬功能紊亂涉及自噬體形成、微管運(yùn)輸、自噬體與溶酶體融合及降解等不同階段，與AD的兩大病理假說(shuō)（Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)和tau蛋白過(guò)磷酸化學(xué)說(shuō)）、Aβ產(chǎn)生、清除及微管相關(guān)蛋白密切相關(guān)[1]。目前關(guān)于AD的治療原則是早發(fā)現(xiàn)早治療，因?yàn)橐坏〢D發(fā)展到產(chǎn)生認(rèn)知功能損害的中后病理階段，這種病理進(jìn)程便很難再逆轉(zhuǎn)?，F(xiàn)有研究顯示，自噬紊亂不僅是除了老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)之外的AD的重要病理特征，更有可能發(fā)生于這些病理特征之前[3,4]。AD轉(zhuǎn)基因鼠4-5月齡時(shí)，紋狀體軸突腫脹成成簇葡萄樣結(jié)構(gòu)、皮質(zhì)和海馬開(kāi)始出現(xiàn)散在的Aβ沉積[5,6]，而此時(shí)行為學(xué)仍尚未體現(xiàn)出認(rèn)知功能損害，直到6月齡時(shí)才能檢測(cè)出AD模型與正常小鼠之間的認(rèn)知水平差異[7]，因此，4月齡時(shí)此模型小鼠仍處于AD發(fā)病早期病理階段，即AD的病理前期階段，在這個(gè)階段進(jìn)行干預(yù)，符合其早發(fā)現(xiàn)早治療的原則，同時(shí)也符合中醫(yī)所提倡的“治未病”。

在自噬體形成的過(guò)程中，自噬相關(guān)蛋白LC3從游離態(tài)的LC3Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば偷腖C3Ⅱ。當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化會(huì)明顯增加，即LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增大，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值通常用來(lái)判斷自噬是否被激活[8]。近年來(lái)，以APP轉(zhuǎn)基因鼠為AD模型，多個(gè)針刺治療AD的機(jī)制研究結(jié)果顯示，針刺可以改善APP轉(zhuǎn)基因鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，降低其腦內(nèi)Aβ水平，并改善相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)元再生、炎性反應(yīng)等[9,10]，也存在針刺對(duì)自噬狀態(tài)產(chǎn)生影響的可能性[11,12]。本課題組選取4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為動(dòng)物模型，通過(guò)免疫組化、免疫熒光、WB的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)在此階段的AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)可能存在的自噬狀態(tài)進(jìn)行初步判斷，并評(píng)估電針在AD的病理前期階段的干預(yù)對(duì)其海馬內(nèi)LC3和Aβ可能產(chǎn)生的影響。

2 材料與方法

2.1 材料

動(dòng)物 4月齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為動(dòng)物模型，4月齡、雄性C57BL/6小鼠（野生型）作為正常對(duì)照。動(dòng)物從南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所購(gòu)入（SCXK(蘇)2015-0001)，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，采用自然晝夜節(jié)律光照，自由進(jìn)食及飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

試劑與儀器 無(wú)菌針灸針（中研太和，0.25 mm×13 mm）；韓式穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)公司，HANs LH202H型）；LC3抗體（美國(guó)，Abcam，ab48394）；免疫組化超敏試劑盒（邁新生物科技，KIT-9706）；DAB顯色試劑盒（邁新生物科技，DAB-0031）；Aβ抗體（美國(guó)，CST，15126）；山羊抗小鼠熒光二抗（美國(guó)，Abcam，ab150115）；山羊抗兔熒光二抗（美國(guó)，Abcam，ab150077）；激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus，F(xiàn)V1000-IX81）；山羊抗兔IgG抗體（中山金橋，ZB-5301）；ECL超敏發(fā)光液（Solarbio，PE0010）。

2.2 方法

2.2.1 分組與干預(yù)方法

16只4月齡、雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為2組：電針組（A）、模型組（M）；8只4月齡、雄性C57BL/6小鼠作為正常組（N）。

電針組：將小鼠以自制鼠袋固定于操作臺(tái)上，按照小鼠針灸穴位圖譜及比較解剖學(xué)方法，在頂骨正中取“百會(huì)”，在兩足底前、中1/3交界處取“涌泉”。選用北京中研太和醫(yī)藥公司生產(chǎn)的一次性針灸針，規(guī)格0.25 mm×13 mm，穴位局部進(jìn)行常規(guī)消毒，刺入2-3 mm，“百會(huì)穴”直接針刺，雙“涌泉穴”接HANs電針儀，采用疏密波，頻率為1/50 Hz，強(qiáng)度1 mA，以針柄震顫，動(dòng)物保持安靜不掙扎嘶叫為度，每次電針15 min，隔日1次。模型組和正常組：以與針刺組相同的方法束縛，每次15 min，隔日1次，共持續(xù)6周。

2.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

（1）腦組織取材

以10%水合氯醛腹腔注射深麻醉小鼠，斷頭，在冰盒上取腦，左半腦放入4%多聚甲醛固定，每組取4塊用于免疫組化檢測(cè)、4塊用于免疫熒光檢測(cè)；右半腦剝離小鼠的海馬及腦皮質(zhì)，放入EP管后，迅速保存于液氮中，用于WB檢測(cè)。

（2）免疫組化法

每組取4塊4%多聚甲醛固定后的腦組織，石蠟包埋，從視交叉處沿冠狀軸切片，厚度為6 μm。染色步驟：脫蠟（二甲苯15 min/次，共3次；100%無(wú)水乙醇5 min/次，共2次；梯度乙醇依次浸泡5 min）；枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)10 min；待恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，每次5 min；過(guò)氧化物酶阻斷劑（邁新生物科技，KIT-9706，A液）室溫孵育10 min；PBS洗3次；山羊血清封閉液（邁新生物科技，KIT-9706，B液）室溫封閉10 min；甩掉封閉液，加LC3抗體，4℃過(guò)夜；次日，PBS洗3次，加二抗（邁新生物科技，KIT-9706，C液），室溫孵育10 min，PBS洗三次，加D液（邁新生物科技，KIT-9706，D液）；PBS洗3次，加DAB顯色2 min；自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染30 s；自來(lái)水沖洗，脫水（70%到100%梯度乙醇浸泡各5 min；100%二甲苯2次各10 min）；中性樹(shù)膠封片。使用DXM1200相機(jī)，用Leica系統(tǒng)連接并采集圖像。每只小鼠取1張免疫組化染色后的切片，在400倍放大下，分別取小鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)的相同視野進(jìn)行拍照。

圖1 小鼠海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)LC3表達(dá)情況（免疫組化×400）

（3）免疫熒光雙標(biāo)法

每組取4塊固定后的腦組織，梯度蔗糖脫水，OCT包埋，從視交叉沿冠狀軸切片，厚度為6 μm，切片置于-20℃保存。染色步驟：從-20℃取出切片，復(fù)溫15 min，PBS洗3次，每次5 min；枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)10 min；待恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，每次5 min；山羊血清封閉液室溫封閉10 min；甩掉封閉液，加一抗（滴加同體積的LC3抗體和Aβ抗體，混勻），4℃過(guò)夜；次日，PBS洗三次，加二抗（滴加同體積的抗兔二抗和抗鼠二抗，混勻），室溫孵育1.5 h；PBS洗三次，DAPI封片。每只小鼠取1張免疫熒光染色后的切片，在激光共聚焦顯微鏡下放大600倍，取小鼠海馬內(nèi)的相同視野拍照。

（4）WB法

每組取8塊小鼠右側(cè)海馬，按比例1∶100加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，勻漿后離心（4℃，10 min，10000 rpm）；離心后取上清液，BCA法蛋白定量試劑盒對(duì)上清液進(jìn)行總蛋白定量，按照濃度80 μg·20 μL-1進(jìn)行配平；采用10%分離膠和4%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗（LC3，1∶1000，β-acting，1∶1000），4℃孵育過(guò)夜；加入二抗（1∶2000），室溫孵育1 h；加入HRP-ECL發(fā)光液，全自動(dòng)曝光機(jī)曝光，并采集圖像；使用Gel-Pro_analyzer軟件分析灰度值，然后對(duì)各組進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量比較。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。WB結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Xˉ±S)表示。各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，方差齊，采用單因素方差A(yù)NOVA分析法；兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 LC3在小鼠腦中的表達(dá)情況

LC3的陽(yáng)性表達(dá)呈深黃色或棕色，從被標(biāo)記的細(xì)胞形態(tài)來(lái)看，被標(biāo)記的細(xì)胞主要是神經(jīng)元，LC3主要存在于神經(jīng)元的胞質(zhì)和軸突中，細(xì)胞核復(fù)染呈現(xiàn)藍(lán)色（圖1）。由于本次實(shí)驗(yàn)使用的LC3抗體既能標(biāo)記出LC3Ⅰ，也能標(biāo)記出LC3Ⅱ，本次免疫組化實(shí)驗(yàn)無(wú)法區(qū)分LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，因此，本次免疫組化法著重于觀察LC3的表達(dá)位置。在各組小鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)，LC3主要表達(dá)于神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突中，各組之間沒(méi)有呈現(xiàn)出明顯差異。但正常組與模型組、電針組比較，其海馬內(nèi)LC3標(biāo)記的神經(jīng)元軸突更連續(xù)、規(guī)整。在小鼠皮質(zhì)中，從LC3所標(biāo)記出的細(xì)胞形態(tài)來(lái)看，仍然主要是神經(jīng)元，LC3仍主要存在于核周（胞質(zhì)）以及軸突中（圖1）。

3.2 LC3和Aβ在小鼠海馬內(nèi)的共表達(dá)情況

圖2為L(zhǎng)C3和Aβ在小鼠海馬CA1區(qū)的共表達(dá)情況。LC3標(biāo)記為綠色熒光，主要表達(dá)在核周（胞質(zhì)）與軸突中，這與免疫組化結(jié)果相一致（圖1）。Aβ標(biāo)記為紅色熒光，正常組與模型組所標(biāo)記出的紅色熒光存在肉眼可見(jiàn)的區(qū)別。Aβ在模型組中有明顯更多的表達(dá)，主要聚集在核周（胞質(zhì)），并且與LC3存在共表達(dá)關(guān)系。細(xì)胞核標(biāo)記為藍(lán)色熒光。

圖2 小鼠海馬CA1區(qū)LC3和Aβ的共表達(dá)情況（免疫熒光×600）

圖3 各組小鼠海馬LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達(dá)情況

圖4 各組小鼠海馬LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值情況

表1 各組小鼠海馬區(qū)LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比較（Xˉ±S）

3.3 小鼠海馬內(nèi)LC3的WB結(jié)果

正常組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值大于模型組，P＜0.01，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；電針組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值大于模型組，P ＞ 0.05（P=0.19），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；電針組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值小于正常組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

中醫(yī)學(xué)注重“治未病”，提倡“未病先防，已病防變”?！端貑?wèn)·四氣調(diào)神大論》如是說(shuō)：“大病已成而后治之，猶譬渴而穿井，斗而鑄錐，不亦晚乎”，這也是現(xiàn)代AD的治療原則——“早發(fā)現(xiàn)早治療”。因此，本研究選取老年斑出現(xiàn)之前的處于AD病理前期的4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對(duì)象。

“腎氣虧虛，痰濁蒙竅”是AD的主要病機(jī)[13,14]。中醫(yī)認(rèn)為AD病位在腦，與腎密切相關(guān)；其病性屬本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜。腎主髓，腎氣虧虛則髓海氣化不足，氣虛則生濁，漸成痰瘀濁毒，蒙蔽腦竅?！鞍贂?huì)”居頭之巔頂，“督脈者…上額交巔上，入絡(luò)腦”，針刺“百會(huì)”有醒腦升陽(yáng)益髓之功；“涌泉”為腎之井穴，為腎經(jīng)之根，針刺“涌泉”可疏通腎經(jīng)，充養(yǎng)髓海，正如《甲乙經(jīng)》云：“忽忽善忘，涌泉主之”。兩穴合用，一上一下，一近一遠(yuǎn)，既可補(bǔ)腎益髓，又可行氣活血、化痰祛濁、開(kāi)竅醒神[13]。

AD早期，腎氣虧虛氣化不利而生濁，自噬活性隨之降低，即自噬不足而導(dǎo)致異常蛋白Aβ在細(xì)胞內(nèi)聚集，但機(jī)體此時(shí)仍能保持相對(duì)平衡狀態(tài)；但隨著病情發(fā)展，聚集的Aβ作為病理產(chǎn)物，進(jìn)一步引發(fā)自噬流紊亂，自噬體及自噬溶酶體聚集反而促成神經(jīng)元內(nèi)Aβ水平暴漲，誘發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而處于低閾值的機(jī)體平衡狀態(tài)被破壞，反過(guò)來(lái)使其本身存在的氣滯、血瘀、痰阻等一系列病理狀態(tài)進(jìn)一步加重，自噬紊亂與之形成惡性循環(huán)，誘發(fā)AD的一系列臨床表現(xiàn)[15]。而針刺治療AD可能具有雙向調(diào)節(jié)作用，對(duì)AD不同病理階段的不同自噬狀態(tài)均可能產(chǎn)生一定的良性調(diào)節(jié)作用。

1992年，Hardy和Higgins提出淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)（Amyloid cascade hypothesis）[16]，Aβ在腦實(shí)質(zhì)中的沉積也一直被認(rèn)為是最終導(dǎo)致阿爾茨海默病發(fā)病的關(guān)鍵。而APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠一直是國(guó)際公認(rèn)的影響Aβ水平的有效評(píng)價(jià)模型[17]。近些年，關(guān)于阿爾茨海默病治療的研究，不斷有“壞”消息傳來(lái)，尤其是兩項(xiàng)重要的臨床試驗(yàn)結(jié)果更加重了悲觀情緒［18,19］，甚至懷疑阿爾茨海默病淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)的準(zhǔn)確性，但以往這些治療方案的關(guān)鍵均集中在考慮Aβ的數(shù)量，生成速度和可逆的Aβ沉積，這中間存在著極大的不確定性，這種不確定性源于患有AD的人類(lèi)腦中的Aβ沉積量的評(píng)估的復(fù)雜性，這種復(fù)雜性又源于人類(lèi)大腦的自然異質(zhì)性。而以Aβ級(jí)聯(lián)連學(xué)說(shuō)作為研究基礎(chǔ)，仍然是值得肯定的，Aβ在AD的病程進(jìn)展中仍處于關(guān)鍵位置。針對(duì)Aβ的治療目前研究顯示，Aβ的治療作用主要取決于Aβ的沉積與tau病理進(jìn)程之間的關(guān)系，由于當(dāng)Aβ在腦內(nèi)沉積達(dá)到一定程度時(shí)，會(huì)產(chǎn)生足夠的“綜合壓力”來(lái)啟動(dòng)、加速tau的病理進(jìn)程，在此之后，Aβ的變化與AD的進(jìn)展之間被認(rèn)為不再存在任何直接相關(guān)性[20]。因此，任何減少Aβ水平的治療干預(yù)只有在這之前才能產(chǎn)生治療效用，而在這之后則會(huì)收效甚微，但這中間的具體時(shí)機(jī)卻很難把握確定。

本次實(shí)驗(yàn)探索性的選用4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行電針干預(yù)，本次實(shí)驗(yàn)的WB結(jié)果顯示，模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值小于正常組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明在AD的病理前期階段，AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的自噬可能處于抑制狀態(tài)。通過(guò)電針干預(yù)，對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的自噬功能是否存在促進(jìn)作用，電針組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而電針組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的均值是略高于模型組的，也許電針能夠促進(jìn)AD模型小鼠海馬內(nèi)的自噬水平；但電針組與正常組的比較，其均值低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明電針組小鼠海馬內(nèi)自噬可能還是處于較低的水平，電針干預(yù)對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的自噬水平的影響可能較弱。但是本次實(shí)驗(yàn)樣本量較小，并綜合各種實(shí)驗(yàn)因素，電針干預(yù)對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的自噬功能是否存在促進(jìn)作用還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

眾多AD的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良性突起及神經(jīng)元胞體內(nèi)存在的大量自噬體和自噬溶酶體是Aβ生成的主要場(chǎng)所[21-23]。本課題組的前期研究顯示[24]，對(duì)4月齡AD轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行電針干預(yù)后，能夠有效地降低AD小鼠海馬內(nèi)的Aβ水平，改善AD小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。本次實(shí)驗(yàn)的免疫熒光結(jié)果顯示，在AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)，LC3與Aβ存在共表達(dá)，因此推測(cè)電針降低AD小鼠腦內(nèi)的Aβ水平可能通過(guò)激活此時(shí)AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的自噬功能來(lái)實(shí)現(xiàn)；LC3的變化只是對(duì)自噬體形成過(guò)程的評(píng)估，本次實(shí)驗(yàn)的WB結(jié)果顯示出的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，電針組略高于模型組，電針對(duì)AD小鼠海馬內(nèi)的自噬體的形成略有促進(jìn)，雖然結(jié)果顯示電針組與模型組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但并不能因此否定電針干預(yù)對(duì)4月齡AD小鼠海馬內(nèi)的自噬水平存在促進(jìn)作用。而Aβ與自噬、自噬與AD的發(fā)病機(jī)制以及電針干預(yù)的具體作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。