吳暢 劉海玲 趙夫娟

[摘要]目的 分析子宮內(nèi)膜樣腺癌（EA）組織中錯(cuò)配修復(fù)蛋白（MMRP）和p53蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系以及兩者的相關(guān)性。方法 本研究中的所有標(biāo)本取自2017年1月～2018年12月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院確診并進(jìn)行手術(shù)治療的EA患者。應(yīng)用免疫組化Envision法檢測(cè)162例EA患者中MMRP及p53蛋白的表達(dá)情況；將4種MMRP中的1種以上表達(dá)缺失定為微衛(wèi)星不穩(wěn)定組（MSI組），全部陽(yáng)性表達(dá)設(shè)為微衛(wèi)星穩(wěn)定組（MSS組）。分析MMRP與p53的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性以及兩種蛋白之間的相關(guān)性。結(jié)果 162例中，MSS組120例，MSI組42例。MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表達(dá)缺失率分別為3.7%、6.2%、10.5%及17.9%；其中共同缺失表達(dá)類(lèi)型為MSH2-MSH6和MLH1-PMS2者分別為4例（2.5%）、15 例（9.3%）。MMRP表達(dá)情況在分化程度、浸潤(rùn)深度方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。p53表達(dá)在年齡、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)Spearman分析得出，MSI與p53成正相關(guān) （r=0.189，P<0.05）。結(jié)論 在EA患者中存在MMRP缺失，且MLH1、PMS2缺失表達(dá)較MSH2和MSH6多見(jiàn)。MSI及p53與EA的臨床病理特征關(guān)系密切，對(duì)EA的預(yù)測(cè)以及惡性程度的評(píng)估具有參考價(jià)值，且兩者成正相關(guān)，可能參與EA的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]子宮內(nèi)膜樣腺癌；MSH2；MSH6；MLH1；PMS2；p53；免疫組織化學(xué)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）4（a）-0008-04

[Abstract] Objective To analyze the relationship between the expression of mismatch repair protein （MMRP） and p53 protein in endometrial adenocarcinoma （EA） tissues and the clinicopathological characteristics and the correlation between the two proteins. Methods All specimens in this study were taken from patients who were diagnosed with EA and underwent surgical treatment at Xiangya Hospital of Central South University from January 2017 to December 2018. The expression of MMRP and p53 protein in EA （162 cases） was detected by immumohistochemistry method Envision. The microsatellite instability group （MSI group） was defined as the expression deficiency of more than one of the four MMRPS， and the microsatellite stability group （MSS group） was defined as all four kinds of MMRP positive expression. The correlation between the expression of MMRP and p53 and clinicopathological features and the correlation between the two proteins were analyzed. Results There were 120 cases in MSS group and 42 cases in MSI group in 162 cases. The expression deletion rate of MSH2， MSH6， MLH1 and PMS2 was 3.7%， 6.2%， 10.5% and 17.9% respectively. Among them， 4 cases （2.5%） and 15 cases （9.3%） had the common co-deletion expression types of MSH2/MSH6 and MLH1/PMS2 respectively. There were statistical differences in the expression of MSI in the degree of differentiation， depth of infiltration （P<0.05）. There were statistical differences in the clinicopathological characteristics of EA patients′ p53， such as age， differentiation degree， infiltration depth and lymph node metastasis （P<0.05）. Spearman correlation analysis showed that there was a obvious positive correlation between MSI and p53 （r=0.189，P<0.05）. Conclusion There is MMRP deficiency in patients with EA， and the expression deficiency in MLH1 and PMS2 is higher than that of MSH2 and MSH6. MSI and p53 are closely related to the clinicopathological characteristics of EA， and have reference value for the prediction of EA and the evaluation of malignancy degree. MSI and p53 protein are positively correlated， which may be involved in the occurrence and development of EA.

[Key words] Endometrial adenocarcinoma； MSH2； MSH6； MLH1； PMS2； p53； Immunohistochemistry

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma）是世界范圍內(nèi)女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%[1-2]。子宮內(nèi)膜癌中最常見(jiàn)的組織類(lèi)型是子宮內(nèi)膜樣腺癌（endometrial adenocarcinoma，EA），占其中的80%～85%。子宮內(nèi)膜癌每年的新發(fā)病例大約是15萬(wàn)例，位列女性癌癥的第五位[3]。近年來(lái)，我國(guó)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，且發(fā)病年齡漸趨年輕化，嚴(yán)重危害女性健康[4]。在大多數(shù)情況下，早期子宮內(nèi)膜癌僅通過(guò)手術(shù)就可以治愈，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移后其預(yù)后很差。

EA常見(jiàn)的分子遺傳學(xué)的改變有抑癌基因PTEN的突變、腫瘤抑制基因p53的突變、KRAS原癌基因的突變及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）。MSI涉及DNA錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因的突變，導(dǎo)致無(wú)法修復(fù)重復(fù)序列（微衛(wèi)星）中DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的錯(cuò)誤。這種修復(fù)機(jī)制的喪失反過(guò)來(lái)導(dǎo)致包含微衛(wèi)星的基因中的移碼突變的累積[5]。MMR提供了幾種遺傳穩(wěn)定功能：它糾正了DNA生物合成錯(cuò)誤，確?；蛑亟M的保真度，并參與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)/控制和細(xì)胞凋亡反應(yīng)的最早步驟。MMR基因缺陷增加細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)，最終導(dǎo)致一個(gè)或幾個(gè)與上皮完整性相關(guān)的基因的破壞[6]。p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類(lèi)腫瘤相關(guān)性最高的基因，野生型p53是一種抑癌基因兼凋亡誘導(dǎo)基因，它編碼一種DNA結(jié)合磷酸化蛋白，參與細(xì)胞周期的調(diào)控和調(diào)亡[7]。本研究采用免疫組化PV法檢測(cè)EA中錯(cuò)配修復(fù)蛋白（mismatch repair protein，MMRP）和p53的表達(dá)情況，探討其與EA的臨床病理特征的關(guān)系，為EA的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷提供客觀指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究中的所有標(biāo)本取自2017年1月～2018年12月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院確診并進(jìn)行手術(shù)治療的162例EA患者。年齡 29～75歲，平均（52±8）歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者9例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者153例；分化程度：高分化子宮內(nèi)膜樣腺癌60例，中分化子宮內(nèi)膜樣腺癌53例，低分化子宮內(nèi)膜樣腺癌49例；浸潤(rùn)深度：黏膜內(nèi)83例，淺肌層60例，深肌層19例；有脈管侵犯者5例，無(wú)脈管侵犯者157例；有神經(jīng)侵犯者1例，無(wú)神經(jīng)侵犯者161例。納入標(biāo)準(zhǔn)：按照2010版WHO標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)病理檢查確診為EA；術(shù)前未進(jìn)行放化療；行子宮全切加雙附件切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：活檢標(biāo)本；免疫組化的資料不完整者。該研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診。

1.2 方法

送檢組織經(jīng)4%中性甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚度切片，HE染色，光鏡觀察。選取腫瘤與正常組織同時(shí)存在的蠟塊，4 μm厚度切片行免疫組化，采用Envision法，一抗為MSH2、MSH6、MLH1、PMS2及p53，抗體及所用免疫組化試劑均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，操作步驟按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以上操作均用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，每例都有HE切片作對(duì)照觀察。

1.3 結(jié)果判定

陽(yáng)性結(jié)果明確，陽(yáng)性信號(hào)的位置正確且染色特征正確。MSH2、MSH6、MLH1、PMS2及p53均定位于細(xì)胞核。對(duì)照組織即腫瘤周?chē)恼Ｉ掀ぜ?xì)胞、腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞MMRP均出現(xiàn)細(xì)胞核著色，可作為內(nèi)對(duì)照[8]。根據(jù)文獻(xiàn)，陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為MMRP和p53在細(xì)胞核明確著色表達(dá)判定為陽(yáng)性，與核染色強(qiáng)弱以及陽(yáng)性細(xì)胞彌漫或局灶分布無(wú)關(guān)；細(xì)胞核不著色判斷為陰性。將4種MMRP中的1種以上表達(dá)缺失定為微衛(wèi)星不穩(wěn)定組（MSI組），全部陽(yáng)性表達(dá)設(shè)為微衛(wèi)星穩(wěn)定組（MSS組）[3]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 24.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 MMRP在EA中的表達(dá)情況

4種MMRP表達(dá)均定位于腫瘤細(xì)胞核。162例EA患者中，MMRP陽(yáng)性者（MMS組）120 例（74%），表達(dá)缺失者（MSI組） 42例，缺失率為26%，其中，MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表達(dá)缺失率分別為3.7%、6.2%、10.5%、17.9%；MSH2 與 MSH6 共同缺失表達(dá)率為2.5%，MLH1 與 PMS2 共同缺失表達(dá)率為9.3%（表1）。

2.2 MMRP在EA不同臨床病理特征中的差異表達(dá)

MSI組與MSS組相比，在分化程度、浸潤(rùn)深度方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表現(xiàn)為在MSI組腫瘤分化程度更低、浸潤(rùn)更深。而在年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯和神經(jīng)侵犯等方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.3 p53在EA不同臨床病理特征中的差異表達(dá)

p53的表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞核。在EA中的陽(yáng)性表達(dá)率為53%，在年齡、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在脈管侵犯和神經(jīng)侵犯方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

2.4 MMRP與p53在EA中表達(dá)的相關(guān)性

MSI與p53表達(dá)在在EA中成正相關(guān)（r=0.189，P<0.05）（表4） 。

3 討論

根據(jù)臨床病理學(xué)和分子遺傳學(xué)特征的不同，子宮內(nèi)膜癌可大致分為兩大類(lèi)，即Ⅰ類(lèi)（雌激素依賴(lài)性腫瘤）和Ⅱ類(lèi)（非激素依賴(lài)性腫瘤）。最常見(jiàn)的子宮內(nèi)膜癌，即EA，臨床上有多種危險(xiǎn)因素，如肥胖、糖尿病、未經(jīng)產(chǎn)、高血壓及絕經(jīng)晚[9-11]。在過(guò)去30年，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)現(xiàn)許多原癌基因和抑癌基因突變、MSI等分子遺傳學(xué)的改變起著非常重要的作用并影響預(yù)后。盡管有最先進(jìn)的一線(xiàn)手術(shù)，激素治療和化療，但腫瘤進(jìn)展到晚期和腫瘤復(fù)發(fā)仍舊會(huì)導(dǎo)致預(yù)后不良和高死亡率，這也是影響子宮內(nèi)膜癌治療的主要問(wèn)題[12]。

有許多修復(fù)機(jī)制用于識(shí)別和去除各種特定類(lèi)型的DNA損傷。完整DNA的恢復(fù)機(jī)制取決于細(xì)胞周期的階段，病變的類(lèi)型和環(huán)境因素。然而，所有修復(fù)機(jī)制都使用細(xì)胞完整的互補(bǔ)DNA鏈作為模板來(lái)恢復(fù)原始鏈[13]。根據(jù)用于修復(fù)的分子和修復(fù)的時(shí)間段，細(xì)胞修復(fù)機(jī)制分為直接和間接修復(fù)機(jī)制。在復(fù)制過(guò)程中，當(dāng)子DNA仍在合成時(shí)，直接修復(fù)機(jī)制由DNA聚合酶或O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）介導(dǎo)[14]。間接修復(fù)則涉及在合成新DNA期間發(fā)生的損傷并且在合成過(guò)程之后發(fā)生。它本質(zhì)上是一個(gè)后復(fù)制過(guò)程，通常彌補(bǔ)直接修復(fù)的不可修復(fù)性。在此合成過(guò)程中DNA復(fù)制的許多蛋白質(zhì)也參與與輔助。間接修復(fù)機(jī)制進(jìn)一步分為三類(lèi)：切除修復(fù)，重組修復(fù)和MMR。

DNA MMR是在DNA穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用的重要酶系統(tǒng)之一，其涉及修復(fù)分裂體細(xì)胞中DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的特定類(lèi)型的錯(cuò)誤[15]。該系統(tǒng)的遺傳損失導(dǎo)致修復(fù)機(jī)制減少，因此導(dǎo)致潛在突變的加速積累（稱(chēng)為MSI）[16]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)MMR基因多達(dá)九種，其中最常見(jiàn)發(fā)生突變的四個(gè)MMR基因分別為MSH2、MSH6、MLH1、PMS2；其中任何一個(gè)的表達(dá)缺失都將導(dǎo)致MMR系統(tǒng)功能異常，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[17]。

p53基因是目前研究得最為廣泛及深入的腫瘤基因之一，它的突變與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。p53基因基因發(fā)生突變后其編碼的蛋白失去了其相應(yīng)的功能，表現(xiàn)為癌基因的形態(tài)，進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[18]。EA中約10%可以檢測(cè)到p53基因突變，多見(jiàn)于3級(jí)EA[19]。

本研究結(jié)果顯示，MSH2缺失者占3.7%，MSH6表達(dá)缺失占6.2%，MLH1缺失者占10.5%，PMS2缺失者占17.9%，提示這4種蛋白的突變情況與EA的發(fā)生、發(fā)展有著密切的相關(guān)性。EA中MMRP表達(dá)缺失以MLH1和PMS2為主，這一結(jié)果與國(guó)外的研究[20]基本一致。本研究結(jié)果中，MMRP表達(dá)情況在在分化程度、浸潤(rùn)深度方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；p53的陽(yáng)性表達(dá)率為53%，且其表達(dá)在年齡、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MSI與p53成正相關(guān)（r=0.189，P<0.05）。

綜上所述，MMRP（MSH2、MSH6、MLH1、PMS2）和p53在EA的臨床病理診斷中有重要參考價(jià)值，MMRP及p53與EA的臨床病理特征關(guān)系密切，對(duì)該疾病的預(yù)測(cè)以及惡性程度的評(píng)估具有重要的參考價(jià)值，且兩者成正相關(guān)，可能參與了EA的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

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（收稿日期：2019-01-24 本文編輯：許俊琴）