孫宇宏，肖功勝，孫寶平，許 剛，馬久太

（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西 西安 710075）

紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花，具有活血通經(jīng)等藥用功效［1］。新疆地理位置和氣候條件獨(dú)特，是我國(guó)紅花種植主要產(chǎn)區(qū)，20世紀(jì)80年代，新疆區(qū)域內(nèi)種植的紅花產(chǎn)量占全國(guó)市場(chǎng)份額的80%［2］。新疆紅花的種植區(qū)域主要集中在天山北麓的吉木薩爾、奇臺(tái)及新疆西北部塔城、伊犁等地區(qū)，紅花主要種植品種包括吉紅一號(hào)及二號(hào)、裕民無(wú)刺等［3-4］。

本研究中通過(guò)對(duì)在新疆范圍不同采集點(diǎn)收集的99批次的紅花樣品進(jìn)行單指標(biāo)化學(xué)成分考察（羥基紅花黃色素A、山柰素）及指紋圖譜相似度聚類分析，對(duì)新疆紅花藥用資源進(jìn)行全方位系統(tǒng)評(píng)價(jià)，為新疆紅花品質(zhì)控制、中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）種植基地建設(shè)等紅花資源開(kāi)發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（包括Waters PDAeλ二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站）；MB45型快速水分測(cè)定儀、DV215CD型電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易＜上海＞有限公司）；UPT-Ⅱ-100L型超純水儀（上海優(yōu)譜實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試藥

山柰素對(duì)照品 （批號(hào)為110861-201209），羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)為111637-201308），蘆丁對(duì)照品（批號(hào)為100030-200707），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純；紅花樣品采集自新疆全境33個(gè)自然村地理位點(diǎn)，每個(gè)地點(diǎn)采集3批次樣品，共采集99批次，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院胡本祥教授鑒定為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品收集

由于新疆地區(qū)紅花采用自種種植，在實(shí)地采樣中，種植戶對(duì)紅花品種不能進(jìn)行系統(tǒng)描述，加之紅花品種在外觀不易區(qū)分，造成收集樣品品種信息不全，故該研究主要對(duì)紅花產(chǎn)地進(jìn)行考察。紅花樣品采集點(diǎn)地理信息見(jiàn)圖1及表1，囊括了新疆紅花產(chǎn)區(qū)中的伊犁州（9個(gè)自然村）、塔城地區(qū)（9個(gè)自然村）、昌吉州（12個(gè)自然村）及烏魯木齊市周邊（3個(gè)自然村），東西跨度500 km，南北跨度350 km。樣品均通過(guò)手工采集，自然晾干，集中編號(hào)后，自封袋密閉包裝后放入陰涼留樣室避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 羥基紅花黃色素A含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按2015年版《中國(guó)藥典（一部）》紅花項(xiàng)下羥基紅花黃色素A含量測(cè)定方法進(jìn)行分析。色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：甲醇 -乙腈 -0.7%磷酸溶液 （26∶2 ∶72）；檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于 3 000［5］。

圖1 紅花樣品采集點(diǎn)地理分布圖

表1 紅花樣品地理信息及樣品狀態(tài)

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取羥基紅花黃色素A對(duì)照品，精密稱定，加25%甲醇制成每1mL含0.13mg的溶液，搖勻，即得。

就當(dāng)前我國(guó)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展對(duì)于金融供給的需求，需要進(jìn)行城鄉(xiāng)經(jīng)濟(jì)農(nóng)村金融體系改革，需要健全完善現(xiàn)有的農(nóng)村金融體系結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)一步擴(kuò)充城鄉(xiāng)經(jīng)濟(jì)中的金融組織隊(duì)伍?？赏ㄟ^(guò)建立和完善多元化復(fù)合型農(nóng)村金融體系：將農(nóng)村政策性金融、農(nóng)村合作金融和農(nóng)村商業(yè)金融包含在的新型農(nóng)村金融體系，建立充分發(fā)揮金融資源配置有效性的農(nóng)村金融市場(chǎng)，從而打造一個(gè)真正支持農(nóng)村發(fā)展建設(shè)的資金循環(huán)的長(zhǎng)效機(jī)制，更好地為農(nóng)村和農(nóng)業(yè)的發(fā)展服務(wù)。

供試品溶液：取收集的99批次紅花樣品，粉碎，粉末過(guò)3號(hào)篩，稱取上述粉末各0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為 300 W，頻率為 50 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。可見(jiàn)，本研究中收集到的33個(gè)種植區(qū)的99批樣品中羥基紅花黃色素A含量具有一定區(qū)域性，位于新疆西部的伊犁州和塔城地區(qū)的紅花樣品中羥基紅花黃色素A的含量高于東部烏魯木齊及昌吉產(chǎn)區(qū)的樣品。

圖2 不同采集地紅花樣品羥基紅花黃色素A區(qū)域特征圖

圖3 不同采集地紅花樣品羥基紅花黃色素A含量分布圖

2015年版《中國(guó)藥典》中要求紅花藥材中的羥基紅花黃色素A含量不少于1.0%。由圖3可見(jiàn)，99批次樣品中羥基紅花黃色素A含量為1.1%的樣品個(gè)數(shù)最多，且不同采集點(diǎn)收集的99批次紅花樣品的羥基紅花黃色素A含量均不低于《中國(guó)藥典》要求。

2.3 山柰素含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25℃ ；流動(dòng)相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（52 ∶48）；檢測(cè)波長(zhǎng)：367 nm。理論板數(shù)按山柰素峰計(jì)應(yīng)不低于 3 000［5］。

2.3.2 溶液制備

供試品溶液：取收集的99批次紅花樣品，粉碎，粉末過(guò)3號(hào)篩，稱取上述粉末各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min。放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液15mL，置平底燒瓶中，加鹽酸溶液5mL，搖勻，置水浴中加熱水解30min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。不同產(chǎn)地紅花樣品的山柰素測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。可見(jiàn)，33個(gè)采集點(diǎn)的紅花樣品中的山柰素含量同樣具有區(qū)域性，位于新疆西部的伊犁州和塔城地區(qū)的紅花平均含量較高（分別為0.074%和0.069% ），昌吉州次之（0.061%），最低的為烏魯木齊市周邊收集的紅花樣品（平均含量為0.056%）。

圖4 不同采集地紅花樣品山柰素區(qū)域特征圖

圖5 不同采集地紅花樣品山柰素含量分布圖

由圖5可見(jiàn)，99批次樣品中山柰素含量為0.054% ～0.059%的樣品較集中，根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（一部）》紅花含量測(cè)定項(xiàng)下的山柰素含量要求不少于0.050%，有少量紅花樣品的山柰素含量低于《中國(guó)藥典》的要求。

2.4 不同產(chǎn)地紅花指紋圖譜相似度比較及聚類分析

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相 A，0.05%三氟乙酸溶液為流動(dòng)相B，按表2中的程序進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL ／min；柱溫：40 ℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng)：288 nm。

表2 紅花指紋圖譜測(cè)定流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.4.2 指紋圖譜繪制

對(duì)照品溶液：以紅花羥基黃色素A、蘆丁作為參照物，取紅花羥基黃色素A及蘆丁對(duì)照品適量，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為30 mg／L的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取收集的99批次紅花樣品，粉碎，粉末過(guò)3號(hào)篩，稱取上述粉末各1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水50mL，稱定質(zhì)量，加熱回流90min。放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

指紋圖譜繪制：分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定。特征色譜圖見(jiàn)圖6，在擬訂色譜條件下，出峰較多，采用對(duì)照品溶液確認(rèn)其中已知成分，包括蘆丁及羥基紅花黃色素A。比較各批樣品的色譜圖，確定共有峰23個(gè)，共有指紋峰的峰面積占總峰面積的90%以上。羥基紅花黃色素A為紅花中的主要成分之一，可見(jiàn)羥基紅花黃色素A的色譜峰峰位居中，峰面積所占比例較大且穩(wěn)定，故選擇該化合物為內(nèi)參照物，確定羥基紅花黃色素A的色譜峰為內(nèi)參照峰。

2.4.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取供試品（八家戶村）溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為 0.4% ～1.1% ，0.5% ～2.7% （n＝5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取供試品（天山村）適量，精密稱定，按2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.1% ～1.1% ，0.2% ～1.4% （n＝ 5），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品（石人子溝村）溶液，分別在 0，2，4，6，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 相似度考察

將所得色譜圖采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件2004版（國(guó)家藥典委員會(huì)）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，將33批次紅花樣品色譜圖進(jìn)行校正匹配并比較，生成全面反映多個(gè)色譜特征的對(duì)照色圖譜（圖7），并以此模式為基準(zhǔn)，計(jì)算每個(gè)色譜圖與之的相似度，若相似度小于0.9則表示不同采集地的紅花樣品物質(zhì)成分構(gòu)成差異較大。

2.4.5 聚類分析

對(duì)33個(gè)不同采集地的紅花樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)紅花羥基黃色素A、蘆丁在內(nèi)的23個(gè)色譜峰，將各色譜峰相對(duì)于參比峰的峰面積量化，得33×23階原始數(shù)據(jù)矩陣，由SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行聚類分析，采用離差平方和法（Ward′s method），并利用歐氏距離（Euclidean）作為樣品的測(cè)度，聚類譜系圖見(jiàn)圖8。聚類分析將33個(gè)不同地域采集地的紅花藥材分為三類，其中伊犁區(qū)域種植的紅花分為一類，而其他兩類則分布于塔城及昌吉區(qū)域。結(jié)果顯示，新疆紅花藥材分布復(fù)雜，其化學(xué)成分的區(qū)域性不明顯。

3 討論

圖6 紅花指紋圖譜特征色譜圖

圖7 不同采集地紅花樣品指紋圖譜比較

圖8 不同采集地紅花指紋圖譜的聚類譜系圖

紅花植物體內(nèi)羥基紅花黃色素A及山柰素合成路徑是一個(gè)龐大的系統(tǒng)，其中涉及合成路徑中的關(guān)鍵酶、調(diào)控基因及環(huán)境因子等［6］，有研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物在紅花中的累積具有明顯的規(guī)律，在不同花期進(jìn)行采摘，紅花中上述物質(zhì)的含量亦不盡相同［7-8］。

可見(jiàn)，不同氣候及土壤特點(diǎn)和農(nóng)戶的采摘習(xí)慣導(dǎo)致了在33個(gè)采集點(diǎn)收集的紅花樣品主要化學(xué)成分羥基紅花黃色素A及山柰素具有一定的區(qū)域性特征，位于塔城及伊犁地區(qū)的紅花樣品中上述化合物的含量高于其他地區(qū)。

由于紅花特有的品種遺傳屬性，決定了來(lái)源于不同地區(qū)紅花藥材的內(nèi)在化學(xué)品質(zhì)特征存在一定差異，張戈等［9］對(duì)30余個(gè)紅花品種的活性成分積累變化規(guī)律的研究結(jié)果表明，紅花不同品種在活性成分積累量等方面存在差異主要由遺傳因素決定，環(huán)境因素的影響居次要地位。

在對(duì)33個(gè)不同采集地收集的紅花樣品進(jìn)行指紋圖譜的測(cè)定及指紋圖譜相似度聚類分析結(jié)果顯示，不同采集點(diǎn)收集的紅花樣品中化合物指紋圖譜聚類地域性差異不明顯，這主要是由于新疆的紅花種植主要通過(guò)自種繁殖，盡管不同地域間氣溫等環(huán)境因素存在差異，但不同地域之間種植種類互有交叉，導(dǎo)致地區(qū)間紅花植株間遺傳及化合物構(gòu)成差異不明顯。