李佩儒 ，周春陽(yáng)，張 譯 ，林 勇 ，李莎莎 ，劉 慧 ，楊春艷 △

（1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院·川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所，四川 南充 637100； 2.川北醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637100）

洋蔥Allium cepaL.，別名玉蔥、蔥頭等，為百合科（Liliaceae）蔥屬Allium草本植物，洋蔥種植和食用已有5 000多年歷史?，F(xiàn)代化學(xué)成分研究表明，其含有多酚、甾體皂苷、有機(jī)硫化物（organosulfur compounds，OSCs）、多糖等次級(jí)代謝產(chǎn)物［1-4］，具有降血糖、調(diào)血脂、抗血栓、抗動(dòng)脈硬化、防治冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和糖尿病等多方面的生理保健功能［5-9］。多酚類物質(zhì)最重要的功能是抗氧化和清除自由基［10］。因此，本研究中采用福林酚法測(cè)定洋蔥總多酚含量，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳顯色條件，并采用2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法評(píng)價(jià)洋蔥醇提物的抗氧化活性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1750型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；FA2004型電子天平（0.000 1 g，上海良平儀器儀表有限公司）；KQ-300DE型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；HH-9型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 試藥

洋蔥（市售）；沒(méi)食子酸（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)為20120227）；蘆?。ǔ啥悸固厣锟萍加邢薰?，批號(hào)為 MUST-16111111）；DPPH（美國(guó) Sigma公司，批號(hào)為 034K1071）；ABTS（Aladdin 公司，批號(hào)為 201406）；水為自制超純水；鎢酸鈉（上海中秦化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20161227），鉬酸鈉（天津市化學(xué)試劑四廠，批號(hào)為20141119），硫酸鋰（天津市巴斯夫化工有限公司，批號(hào)為20160409）等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總多酚含量測(cè)定

2.1.1 溶液制備

稱取干燥的沒(méi)食子酸10.00 mg，精密稱定，加蒸餾水適量，超聲溶解，放冷，以蒸餾水定容至100 mL，制成每1 mL含0.1 mg沒(méi)食子酸的溶液，得對(duì)照品溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取鮮洋蔥（市售）于60℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥，粉碎；取洋蔥粉217.5 g，以70%乙醇（料液比為1∶10）溶解，超聲波輔助提取法（UAE）提取3次（每次30 min），得洋蔥醇提物163.5 g，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫蝗⊙笫[醇提物0.14 g，加水溶解并定容至100 mL，抽濾，得供試品溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取鎢酸鈉8g和鉬酸鈉2g置圓底燒瓶中，用56mL蒸餾水溶解，加入4 mL 85%磷酸溶液和8 mL濃鹽酸，文火回流10 h，然后加入1.2 g硫酸鋰及6 mL氫氧化鈉，加熱沸騰15 min至亮黃色，不得帶微藍(lán)和綠色。冷卻，移入100 mL容量瓶中，定容，貯于棕色瓶中，得福林試劑，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各0.4 mL，置5 mL容量瓶中，加入1 mL水，搖勻，加入福林試劑0.5 mL，搖勻，放置1 min；加入10%碳酸鈉溶液1 mL，加水稀釋至刻度，充分搖勻后置60℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)60 min，以相應(yīng)的提取溶劑為空白溶劑，于550～850 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄紫外光譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1。洋蔥醇提物和沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液與福林試劑反應(yīng)后均在760 nm波長(zhǎng)處有穩(wěn)定的最大吸收峰，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為760 nm。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：將2.1.1項(xiàng)下所配溶液稀釋5倍，精密吸取對(duì)照品溶液 0.30，0.50，0.70，0.90，1.10，1.25 mL，分別置5 mL容量瓶中，各加1 mL水搖勻，再加0.5 mL福林試劑，充分搖勻，加入1.0 mL 10%碳酸鈉溶液，混勻，以蒸餾水稀釋至刻度。分別在60℃下水浴60 min，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各吸光度值。以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝0.116 6X+0.096 2，R2＝0.999 5（n＝6）。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度在 1.2 ～5.0 mg／L范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

圖1 對(duì)照品（DZ01212）和洋蔥醇提物（GSP1212）紫外吸收光譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取同一供試品溶液0.4 mL，按照洋蔥總多酚含量測(cè)定的最佳顯色條件，顯色后室溫下放置，分別于 15，30，45，60，90，120 min 時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果顯色后2 h內(nèi)總多酚含量為30.606 1 mg／g，RSD為0.1149%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下2h內(nèi)穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取同一對(duì)照品溶液0.4mL，共5份，分別置5mL容量瓶中，按洋蔥總多酚含量測(cè)定的最佳顯色條件，測(cè)定吸光度。結(jié)果含量為30.640 7 mg／g，RSD為0.137 8%（n＝5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別稱取洋蔥粉末1.0 g，平行16份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按洋蔥總多酚含量測(cè)定的最佳顯色條件，測(cè)定吸光度。結(jié)果洋蔥總多酚平均含量為 29.908 8 mg／g，RSD為 5.169 4% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別取洋蔥粉末6份，精密稱取每份1.0 g，各加入一定量的沒(méi)食子酸對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，測(cè)定沒(méi)食子酸含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 洋蔥總多酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2 單因素試驗(yàn)

圖2 各因素對(duì)洋蔥總多酚含量測(cè)定影響

精密量取供試品溶液 0.4 mL，按 1.2.2項(xiàng)下方法顯色，采用單因素優(yōu)化法分別對(duì)體系中福林酚體積（0.25，0.40，0.50，0.60，0.75 mL），10% 碳酸鈉體積（0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 mL），顯色溫度（30，40，50，60，70 ℃），顯色時(shí)間（30，40，50，60，70 min）對(duì)總多酚含量測(cè)定的影響進(jìn)行考察（以上試驗(yàn)均平行測(cè)定3次）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2 A可見(jiàn)，洋蔥醇提物的吸光度值隨反應(yīng)溫度升高呈先升后降的變化趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃時(shí)，洋蔥醇提物的吸光度值最大，反應(yīng)溫度超過(guò)60℃后，吸光度值逐漸降低，說(shuō)明多酚類化合物在高溫下不穩(wěn)定。因此，確定最佳的顯色溫度為60℃。

由圖2 B可見(jiàn)，多酚類物質(zhì)與顯色劑反應(yīng)需要一個(gè)過(guò)程，顯色反應(yīng)60 min內(nèi)，洋蔥醇提物吸光度值明顯增大，顯色反應(yīng)迅速；反應(yīng)60 min后，洋蔥醇提物吸光度值逐漸下降。因此，確定最佳顯色時(shí)間為60 min。

由圖2 C可見(jiàn)，隨著福林試劑用量的增加，洋蔥醇提物的吸光度值呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)福林試劑用量為0.5 mL時(shí)，吸光度值達(dá)最大值。因此，確定福林試劑的最佳用量為0.5 mL。

由圖2 D可見(jiàn)，10%碳酸鈉溶液是福林酚比色法中反應(yīng)的緩沖液，能為顯色劑與酚類環(huán)境提供堿性環(huán)境，使多酚與顯色劑反應(yīng)后在堿性環(huán)境下顯藍(lán)色。可見(jiàn)，洋蔥醇提物的吸光度值隨碳酸鈉溶液加入量的增加而升高，但當(dāng)加入量超過(guò)1.0 mL時(shí)，吸光度值迅速降低。因此，確定10%碳酸鈉溶液的最佳加入量為1.0 mL。

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上以顯色溫度（因素A）、顯色時(shí)間（因素B）、福林酚體積（因素C）、10%碳酸鈉溶液體積（因素D）為考察因素，測(cè)定洋蔥醇提物中總多酚的含量，優(yōu)化洋蔥醇提物總多酚含量測(cè)定的顯色條件。設(shè)計(jì)正交驗(yàn)，其因素水平見(jiàn)表2。

表2 洋蔥總多酚含量測(cè)定 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

由表3及表4可見(jiàn)，洋蔥總多酚含量測(cè)定的最佳顯色條件為：顯色溫度60℃，顯色時(shí)間60 min，福林酚體積 0.6 mL，10% 碳酸鈉溶液體積 0.75 mL。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表

2.4 抗氧化活性研究

圖3 洋蔥醇提物抗氧化活性

參考文獻(xiàn)［11］方法進(jìn)行洋蔥醇提取物的抗氧化活性試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。可見(jiàn)，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，洋蔥醇提物的抗氧化能力具有濃度依賴性。其中，洋蔥醇提物對(duì) ABTS自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）值為（187.7±0.08）mg／L，而 陽(yáng) 性 對(duì) 照 蘆 丁 對(duì) ABTS 和DPPH 自 由 基 的IC50值 為 （12.87±0.21）mg／L 和（10.29 ± 0.17）mg ／L。

3 討論

多酚（polyphenols）包括黃酮、酚酸、芪類和木質(zhì)素等，是植物界中最豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物［12］。福林酚法是利用在堿性條件下，多酚類化合物可以將磷鎢鉬酸還原成藍(lán)色的原理，顏色深淺與多酚含量呈正相關(guān)，可用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定［13］。多酚類物質(zhì)的抗氧化功能與多酚的結(jié)構(gòu)有關(guān)，酚羥基中的鄰位酚羥基極易被氧化［14］，是良好的抗氧化劑。酚羥基可提供活潑氫，使自由基滅活，本身被氧化形成含有鄰二酚結(jié)構(gòu)的自由基而具有較高的穩(wěn)定性［15］。

洋蔥研究較多的為黃酮，而對(duì)多酚的研究相對(duì)較少。其中，SIRACUSA等［16］報(bào)道洋蔥總多酚的含量為123.5 mg／kg（鮮重），且其主要成分為槲皮素 3，4′-二 -O-葡萄糖苷，槲皮素4′-O-葡萄糖苷等。此外，唐遠(yuǎn)謀等［17］采用微波輔助提取法（MAE），得到洋蔥總多酚的含量為 12.45 mg ／g。另外，陳晨等［18］研究了鮮切洋蔥貯藏期間多酚成分的變化。本研究中采用UAE法提取洋蔥多酚，并采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化其含量測(cè)定方法。結(jié)果表明，洋蔥醇提物具有一定的抗氧化能力，且其抗氧化能力在一定濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴性。

民間洋蔥常用于防治動(dòng)脈硬化癥［19］，而氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用［20］。因此，本研究為洋蔥在保健食品、藥品領(lǐng)域中的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考。