李寧，吳海明，耿榮鑫，唐其柱*

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢大學(xué)心血管病研究所，心血管病學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢 430060)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中的發(fā)生率約為12%。與非糖尿病患者相比，糖尿病極大增加了患者心血管疾病的發(fā)病率及死亡率[1]。DCM以心室舒張功能和(或)收縮功能障礙為主要特征，可見(jiàn)于1型和2型糖尿病患者，且其發(fā)病獨(dú)立于高血壓、冠心病及其他心血管疾病。DCM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及到線粒體功能障礙、脂質(zhì)代謝改變、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、炎癥、表觀遺傳修飾等多項(xiàng)病理生理過(guò)程的異常改變[2,3]，而這些異常的病理生理過(guò)程與多種基因的異常表達(dá)或突變密切相關(guān)，例如S6K1、CD36、CTRP3、SIRT1及PPAR-α[4]。目前臨床上DCM的診斷主要依賴于血清鈉尿肽(natriuretic peptide，NAPP)水平及其他非侵入性檢測(cè)的結(jié)果，包括超聲心動(dòng)圖、X-ray和心電圖。但這些方法缺乏特異性和準(zhǔn)確性，導(dǎo)致臨床醫(yī)師很難早期精準(zhǔn)診治，致使很多DCM患者錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)，增加了死亡風(fēng)險(xiǎn)[1]。因此，篩選DCM的特異且敏感的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)有助于今后更加深刻地認(rèn)識(shí)DCM的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，同時(shí)有利于DCM的早期診斷和精準(zhǔn)治療。

近年來(lái)，生物信息學(xué)的飛速發(fā)展使我們對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)更加全面且深刻，一方面我們能夠通過(guò)高通量測(cè)序篩查健康人群和患者病灶組織或血清中差異表達(dá)的基因及蛋白，另一方面，我們還能夠了解這些基因的轉(zhuǎn)錄及表觀遺傳修飾情況[5]。因此，為了將這些基因芯片快速運(yùn)用于臨床實(shí)踐，有必要及時(shí)篩選出一些關(guān)鍵基因并制定合適的方案將其常規(guī)應(yīng)用于臨床。

本研究通過(guò)對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)2R(gene expression omnibus 2R，GEO2R)平臺(tái)DCM患者基因表達(dá)芯片(GSE26887)進(jìn)行分析，篩選出5個(gè)上調(diào)和5個(gè)下調(diào)最明顯的DEGs，并利用基因本體論(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)對(duì)所有DEGs的功能及通路進(jìn)行富集分析。此外，借助STRING軟件，篩選了連接度最高的15個(gè)hub基因。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(national center of biotechnology information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)下載DCM患者的心肌組織基因表達(dá)芯片GSE26887(該數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)且免費(fèi))?；虮磉_(dá)芯片GSE26887共含有24例人類樣本，包括5名健康人群、7例DCM患者及12例心肌梗死所致的缺血性心肌病患者。本研究?jī)H分析健康人群(非DCM組，n=5)和DCM患者(DCM組，n=7)心肌中的DEGs。該芯片由Greco等上傳，依托于GPL6244平臺(tái)[(HuGene-1_0-st)Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array]。此外，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE26887的矩陣文件，該文件中包含了所有樣本全部被檢測(cè)基因的表達(dá)水平。

DCM組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)血糖≥126 mg/dl；(2)既往有2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)史和(或)接受過(guò)抗糖尿病治療，且隨后被診斷為心力衰竭。非DCM組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)血糖<100 mg/dl；(2)糖化血紅蛋白為4.8%～6.0%；(3)心功能正常且無(wú)其他心臟病史。非DCM組人群與DCM組患者的年齡、性別、吸煙情況、血脂水平均匹配，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[2]。

1.2 方法與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.2.1 DEGs的篩選 GEO2R平臺(tái)是GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中以R語(yǔ)言為基礎(chǔ)的交互式分析工具[6]。本研究利用GEO2R平臺(tái)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)對(duì)DCM患者及非DCM組人群心肌組織的DEGs進(jìn)行篩選。以基因倍數(shù)改變(fold change，F(xiàn)C)大于2，即log2FC>1作為上調(diào)2倍DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)；以log2FC<-1作為下調(diào)2倍DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。下載該芯片所有被檢測(cè)基因原始表達(dá)含量數(shù)據(jù)。為了進(jìn)一步將本芯片的DEGs可視化，采用ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)在線制圖網(wǎng)站繪制DEGs的熱圖及火山圖。

1.2.2 GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析 GO分析能夠注釋一組基因的多項(xiàng)功能，包括分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular components，CC)和生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)。KEGG本質(zhì)上是一種我們獲得基因生物學(xué)功能甚至高級(jí)基因組信息的資源，KEGG信號(hào)通路分析能夠提示某些疾病相關(guān)基因及藥物的生物學(xué)通路。在本項(xiàng)研究中，我們通過(guò)DAVID(http://david.ncifcrf.gov，6.7版)執(zhí)行了該芯片的GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)能夠識(shí)別健康個(gè)體與患者之間的核心DEGs和關(guān)鍵基因模塊。首先將本芯片中全部的DEGs導(dǎo)入STRING在線分析軟件(http://www.stringdb.org/)，預(yù)測(cè)這些基因所編碼蛋白之間的相互作用；隨后，在STRING分析的基礎(chǔ)上，采用Cytoscape軟件平臺(tái)構(gòu)建基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)這些基因的連接度排序，篩選出連接度最高的前15個(gè)hub基因。

2 結(jié) 果

2.1 2組間DEGs的篩選結(jié)果

共篩選出236個(gè)DEGs，包括134個(gè)上調(diào)基因及102個(gè)下調(diào)基因，具體分布如圖1所示，圖2顯示的是12例標(biāo)本中上調(diào)差異最大的前25個(gè)基因與下調(diào)差異最大的前25個(gè)基因。在236個(gè)DEGs中，差異最大的5個(gè)上調(diào)基因分別為：NPPA，SFRP4，DSC1，NEB和FRZB；差異最大的5個(gè)下調(diào)基因分別為：SERPINE1，SERPINA3，ANKRD2，XRCC4和S100A8。由于這些基因在DCM患者心肌組織中表達(dá)差異大，因此有望成為DCM診斷的標(biāo)志物，其基本生物學(xué)功能如表1所示。

2.2 GO富集分析

分析本芯片中所有的DEGs，發(fā)現(xiàn)上調(diào)DEGs的BP主要富集在G-蛋白偶聯(lián)嘌呤能核苷酸受體信號(hào)通路、脂肪酸代謝、線粒體膜電位、細(xì)胞外基質(zhì)的組織及線粒體通透性轉(zhuǎn)換，而下調(diào)DEGs的BP主要富集在炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)攝入、藥物反應(yīng)、免疫反應(yīng)、血小板脫顆粒(表2)。上調(diào)DEGs的CC主要與膜完整性、質(zhì)膜、外泌體、胞外空間及細(xì)胞外區(qū)域的完整性相關(guān)，而下調(diào)DEGs的CC主要包括質(zhì)膜、胞外空間、胞外區(qū)域、外泌體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；上調(diào)DEGs的MF包括鋅離子結(jié)合、鈣離子結(jié)合、肝素結(jié)合、膠原結(jié)合、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸結(jié)合，而下調(diào)DEGs的MF主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)結(jié)合、線粒體解耦、細(xì)胞因子活性、肌動(dòng)蛋白結(jié)合和磷酸酶活性。

圖1 2組間DEGs分布火山圖Figure 1 Volcano plot of DEGs between two groupsDEGs:differentially expressed genes;FC:fold change.

圖2 2組間DEGs分布熱圖Figure 2 Heatmap of DEGs between two groupsDCM:diabetic cardiomyopathy;DEGs:differentially expressed genes.

表1 DEGs的基本生物學(xué)功能Table 1 Biological function of DEGs

DEGs:differentially expressed genes;FC:fold change;NF-κB:nuclear factor kappa-B;TLR:Toll like receptor.

2.3 KEGG信號(hào)通路分析

下調(diào)的DEGs主要富集在磷脂酰肌醇-3-羥激酶/絲蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol-3 kinases/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信號(hào)通路、絲裂原激活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號(hào)通路及Toll樣受體信號(hào)通路，而上調(diào)的DEGs則主要與藥物代謝-細(xì)胞色素酶P450信號(hào)通路相關(guān)(表3)。

表2 2組間心臟組織DEGs的GO富集分析Table 2 GO analysis of DEGs in cardiac tissue between two groups

GO:gene ontology;DEGs:differentially expressed genes;NADP:nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.

表3 2組間心臟組織DEGs的KEGG富集分析Table 3 KEGG pathway analysis of DEGs in cardiac tissue between two groups

DEGs:differentially expressed genes;KEGG:Kyoto encyclopedia of genes and genomes;PI3K-Akt:phosphatidylinositol-3 kinases/serine-threonine kinase;MAPK:mitogen-activated protein kinase;HIF-1:hypoxia-inducible factor-1;TNF:tumor necrosis factor.

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及hub基因的篩選

利用STRING在線分析工具構(gòu)建所有DEGs間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，共有162個(gè)DEGs間存在相互作用網(wǎng)絡(luò)，我們挑選出了連接度最高的15個(gè)hub基因，依次為IL-6，MYC，ACTA2，SERPINE1，ASPN，SPP1，KIT，TFRC，F(xiàn)MOD，PDE5A，MYH6，F(xiàn)PR1，C3，CDKN1A及SOCS3，其中上調(diào)DEGs為IL-6，ACTA2，ASPN，KIT，F(xiàn)MOD及PDE5A，而下調(diào)DEGs為MYC，SERPINE1，SPP1，TFRC，MYH6，F(xiàn)PR1，C3，CDKN1A和SOCS3(圖3)。IL-6是連接度最高的hub基因，可以與32個(gè)下調(diào)DEGs及15個(gè)上調(diào)DEGs發(fā)生相互作用。此外，這15個(gè)hub基因間也存在較強(qiáng)的相互作用，例如ACTA2能夠與FMOD，IL-6，MYH6，MYC及ASPN發(fā)生相互作用；SPP1與KIT，IL-6，MYC和SERPINE1發(fā)生相互作用。由于這些hub基因連接緊密，處于PPI網(wǎng)絡(luò)的樞紐，因此有望成為DCM治療的靶點(diǎn)。

圖3 2組間DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of DEGs between two groupsDEGs:differentially expressed genes;PPI:protein-protein interaction.

3 討 論

近幾十年來(lái)，糖尿病一直是具有高發(fā)病率及高死亡率的慢性疾病。據(jù)估計(jì)，到2030年，全球?qū)⒂屑s4.5億糖尿病患者。DCM是糖尿病患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者主要的死亡原因，近年來(lái)發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。由于DCM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜以及其在早期并無(wú)特異性癥狀，目前尚無(wú)診斷及治療的有效手段[7]。因此，及時(shí)尋找到DCM患者血漿和心肌組織中的診斷標(biāo)志物和核心治療靶點(diǎn)具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的DCM患者及健康人群心肌組織mRNA芯片進(jìn)行全面分析，共發(fā)現(xiàn)236個(gè)DEGs(占全部基因的2.6%)，其中上調(diào)基因134個(gè)，下調(diào)基因102個(gè)。同時(shí)，我們還根據(jù)這些DEGs的相互作用關(guān)系構(gòu)建了PPI，挑選出連接度最高的15個(gè)hub基因。

白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)是一種重要的細(xì)胞因子，在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著多種生理作用，可由單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞系和成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞類型分泌[8]。在天然免疫和適應(yīng)性免疫中，IL-6刺激可引起機(jī)體不同的生物學(xué)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6預(yù)處理能夠增加心臟成纖維細(xì)胞膠原纖維的合成，同時(shí)促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠心臟間質(zhì)纖維化[9]。在鏈脲霉素誘導(dǎo)的DCM大鼠模型中，敲除IL-6能夠改善大鼠心臟功能，同時(shí)減輕大鼠心肌纖維化，其機(jī)制可能與IL-6對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和微小RNA-29(microRNA-29，miR-29)的激活有關(guān)[10]。此外，有研究亦揭示外周血中IL-6水平升高與心力衰竭患者疾病嚴(yán)重程度和死亡率之間存在顯著正相關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6作為上調(diào)的hub基因，具有最高的連接度，意味著IL-6可能在DCM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。此外，KEGG分析顯示，IL-6在PI3K/Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路中均明顯富集。既往研究表明，HIF-1在糖尿病早期異常表達(dá)導(dǎo)致了DCM的發(fā)展[12]。在糖尿病視網(wǎng)膜病模型中，抑制HIF-1信號(hào)通路能夠明顯降低IL-6和TNF-α的表達(dá)[13]。但在DCM中，IL-6的表達(dá)是否受到HIF-1的調(diào)節(jié)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

GO和KEGG分析結(jié)果顯示，細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和免疫紊亂可能在DCM中發(fā)揮重要作用。心臟炎癥是心力衰竭的重要特征之一。DCM患者心臟中促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平增高，同時(shí)伴有多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，包括巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞[13]。在DCM患者體內(nèi)，某些分子如c-jun氨基端激酶、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、p38-MAPK的激活能夠加重炎癥，且與機(jī)體的胰島素抵抗也存在一定的相關(guān)性[14]。實(shí)際上，在心力衰竭發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，免疫系統(tǒng)紊亂并非獨(dú)立于炎癥激活。在慢性心力衰竭中，免疫系統(tǒng)激活后通常有助于補(bǔ)體系統(tǒng)活化、炎性細(xì)胞因子分泌以及自身抗體的產(chǎn)生和釋放。在DCM發(fā)病中，心臟左室收縮和舒張功能的異常則與免疫細(xì)胞的侵襲浸潤(rùn)密切相關(guān)。本研究中，KEGG分析結(jié)果揭示，多個(gè)DEGs富集于Toll樣受體信號(hào)通路。Toll樣受體作為一種膜錨定蛋白，存在于多種細(xì)胞類型中，如免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)和非免疫細(xì)胞(心肌細(xì)胞)。心肌組織中的Toll樣受體能與炎癥小體相互作用，通過(guò)活性氧類(reactive oxygen species，ROS)的過(guò)度生成及NF-κB信號(hào)通路的激活來(lái)誘導(dǎo)心臟炎癥反應(yīng)[15]。此外，在本研究中所篩選出的差異最大的5個(gè)上(下)調(diào)基因及hub基因中，多個(gè)基因也與炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)密切相關(guān)，如SERPINA3(免疫反應(yīng))、S100A8(調(diào)節(jié)炎癥，氧化應(yīng)激并激活Toll樣受體4)、ANKRD2(調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng))、FPR1(炎癥反應(yīng))、C3(免疫應(yīng)答)、CDKN1A(炎癥反應(yīng))、SOCS3(調(diào)節(jié)白介素)、IL-6(促炎性細(xì)胞因子)。

總之，本研究基于生物信息學(xué)首次對(duì)DCM和健康體檢人群心肌組織中的mRNA表達(dá)差異進(jìn)行分析，共篩選出10個(gè)表達(dá)差異最大的基因。將這些標(biāo)志物結(jié)合臨床，有望提高DCM診斷準(zhǔn)確率。同時(shí)，依據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)，挑選出了15個(gè)處于PPI網(wǎng)絡(luò)樞紐、有望成為DCM治療靶點(diǎn)的hub基因。最后，本研究對(duì)所有DEGs功能注釋，首次從生物信息學(xué)角度證實(shí)炎癥、免疫紊亂、代謝紊亂、線粒體功能障礙等與DCM的發(fā)病密切相關(guān)。