吳昕陽(yáng),李麗紅,王晶瑩,謝 風(fēng),何成彥,方 玲

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶活化蛋白(YWHAE)，也稱為14-3-3ε是14-3-3家庭的成員。這個(gè)家族的成員是約30 kDa酸性多肽，具有高度調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能的保守序列，包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、粘附和惡性轉(zhuǎn)化[1]。14-3-3蛋白是真核生物體內(nèi)存在的可溶性酸性蛋白,它通過(guò)與靶蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)靶蛋白來(lái)發(fā)揮其生理學(xué)的功能.14-3-3蛋白最初由Moore和Perez于1967年在牛腦中分離的出來(lái)的，被認(rèn)為是細(xì)胞分裂和凋亡中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)和抗凋亡蛋白[2]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已鑒定出14-3-3家族的七種同種型(,?,?,?,,和)[3]。研究表明，在14-3-3蛋白家族中，14-3-3δ亞型具有抑制腫瘤活性的特點(diǎn),而其他亞型蛋白則具有促癌活性。YWHAE與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，主要在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、擴(kuò)散遷移及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑發(fā)揮作用[4]。YWHAE在結(jié)直腸癌細(xì)胞，腎癌細(xì)胞以及胃癌組織中發(fā)揮著突出的作用。有研究表明，Nagappan等人觀察到感染幽門螺旋桿菌的胃黏膜層組織中的YWHAE的表達(dá)顯著增加，表明YWHAE與幽門螺旋桿菌導(dǎo)致的相關(guān)疾病有關(guān)[5]。盡管14-3-3蛋白的不同亞型在各種腫瘤的分布與作用不盡相同.但是越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為,YWHAE在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到一個(gè)很重要的作用。我們采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用和蛋白質(zhì)印記技術(shù)，檢測(cè)YWHAE在結(jié)直腸癌(CRC)中的表達(dá)情況。并初步探討了YWHAE在CRC中的潛在的分子機(jī)制，為臨床診療工作提供新的腫瘤標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采集吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院26例結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本，所有這些病例經(jīng)病理診斷為腺癌。同時(shí)，取距離癌組織10 cm以上的癌旁組織，所有患者術(shù)前均未接受放化療。待標(biāo)本離體后，液氮速凍。-80℃冰箱內(nèi)保存。所有組織均經(jīng)過(guò)吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)后方可用于研究。

1.2 試劑與儀器

二硫代蘇糖醇(DTT)、TPCK修飾的測(cè)序級(jí)胰酶購(gòu)自于promega。DNA酶、RNA酶均購(gòu)自于Sigma公司。Thermo Fisher Scientific公司購(gòu)置的LTQXL離子肼質(zhì)譜儀。液相色譜分析儀由安捷倫公司提供。蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)置于Bio-Rad公司。胰酶、蛋白裂解液購(gòu)于beyotime公司。超凈工作臺(tái)購(gòu)于蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1組織蛋白的提取、測(cè)定蛋白濃度及電泳分離 分別取出液氮保存的26對(duì)組織標(biāo)本20 mg后，在勻漿器中研磨。然后利用蛋白提取試劑盒提取總蛋白質(zhì)。使用二辛可寧酸蛋白定量試劑盒，在UV-2000型分光光度計(jì)的590 nm處比色，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)含量(mg/ml)。將剩余樣品加入4×上樣緩沖液，100℃加熱10 min后，用聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行電泳蛋白分離。

1.3.2組織蛋白的還原、烷基化和胰蛋白酶消化 將凝膠帶切成20 mm×2 mm的條帶，加入10 mM DTT，56℃避光還原1 h。待反應(yīng)物降至室溫后，加入25 mM的碘乙酸溶液，使其烷基化，室溫下避光反應(yīng)20 min。最后，按1∶50(胰酶:蛋白質(zhì))的比例向混合物中加入測(cè)序級(jí)胰酶，在37℃酶切5 h,酶切后樣品用真空抽干后分裝，-80℃保存。

1.4 液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析、數(shù)據(jù)庫(kù)搜索以及蛋白質(zhì)鑒定

本研究使用6550 iFunnel四級(jí)桿-飛行時(shí)間液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用儀進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集。液相色譜采用溶液A:0.1%甲酸和溶液B:90%乙腈的梯度流動(dòng)相，在流速為0.5 μl/min的75 μm×150 mm分離柱上分離富集肽(0-2 min,0%-3%B;2-70 min,3%-35%B;70-75 min,35%-45%B;75-85 min,45%-95%B;85-88 min,95%-103% B.)。分離的多肽在C18色譜柱上富集后，通過(guò)雙擊離子漏斗與前端的六孔毛細(xì)管的配合，高效的將多肽導(dǎo)入到進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。質(zhì)譜儀氮?dú)獗３衷?50℃，流量為9L/min；質(zhì)量范圍為50-3000(m/z)，掃描速率為4譜/秒，掃描方式為數(shù)據(jù)依賴方式(DDA)。將獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)傳輸?shù)劫|(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件，在SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的‘人類’進(jìn)行檢索。多肽>2的蛋白質(zhì)譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行鑒定。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法試驗(yàn)

對(duì)選定的目標(biāo)蛋白YWHAE進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)。30 μg的蛋白樣品在10%的SDS-PAGE凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉2 h。PVDF膜在4℃的溫度下與YWHAE和β-Actin一抗孵育過(guò)夜，再用1∶2 000辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗體室溫下孵育1 h。最后，蛋白條帶以化學(xué)發(fā)光法顯色獲得。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織酶解產(chǎn)物中表達(dá)蛋白的鑒定

酶解產(chǎn)物進(jìn)行液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析，得到多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到肽段和蛋白的鑒定信息。經(jīng)鑒定，其中腫瘤組織與癌旁健康組織中共得到686個(gè)多肽種類,483個(gè)蛋白質(zhì)種類。

2.2 大腸癌組織與癌旁健康組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

應(yīng)用譜圖計(jì)數(shù)法，根據(jù)鑒定蛋白的二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)目與蛋白豐度呈正相關(guān)的原理，對(duì)質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。將兩樣品中蛋白譜圖數(shù)的比值≥2視為表達(dá)具有差異。結(jié)果表明，共有68種差異表達(dá)蛋白，其中42種蛋白在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，26種蛋白在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)(所有P<0.05)。本文重點(diǎn)研究上調(diào)表達(dá)的YWHAE，其質(zhì)譜結(jié)果見圖1。

圖1 YWHAE質(zhì)譜圖

2.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)比較YWHAE在結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的表達(dá)

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)直腸癌及癌旁組織中YWHAE蛋白的表達(dá)。如圖2所示，YWHAE在結(jié)直腸癌中明顯上調(diào)表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的結(jié)果。

A:大腸癌組織;B:大腸癌癌旁組織

3 討論

研究表明，YWHAE在包括胃癌[6]、肝癌[7]、腎癌[8]等多種腫瘤中表達(dá)顯著增高，高表達(dá)的YWHAE可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和抑制凋亡。其機(jī)制可能是通過(guò)抑制YWHAE基因減少胞內(nèi)線粒體、通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑破壞YWHAE蛋白配體關(guān)聯(lián)等相關(guān)。Ko等[7]通過(guò)對(duì)114例肝癌病人的組織診斷發(fā)現(xiàn)，YWHAE的高表達(dá)與肝癌的遷移有關(guān)。Liang等[8]發(fā)現(xiàn)YWHAE上調(diào)腎臟癌組織是與其對(duì)應(yīng)的腎組織的1.44倍，并且體外YWHAE的過(guò)表達(dá)可以有限地促進(jìn)腎腫瘤細(xì)胞的異常生長(zhǎng)。有文獻(xiàn)表明，YWHAE蛋白的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了CagA對(duì)NF-êB的激活；相反，YWHAE蛋白的敲除抑制了CagA對(duì)NF-êB的激活這些結(jié)果表明CagA增強(qiáng)YWHAE介導(dǎo)的NF-êB反式激活，為CagA誘導(dǎo)的幽門螺桿菌相關(guān)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制提供了新的線索。在SGC7901細(xì)胞中，Yan等人發(fā)現(xiàn)YWHAE的過(guò)度表達(dá)激活了ERK / MAPK通路并增加了細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，表明YWHAE的原始作用[5]。在體外，我們證明了YWHAE可以通過(guò)下調(diào)MYC和CDC25B，誘導(dǎo)細(xì)胞停滯和抑制細(xì)胞入侵和遷移。另一方面，MYC致癌基因能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖，侵襲和凋亡通過(guò)CDC25B和CDC25B的上調(diào)進(jìn)行遷移YWHAE的下調(diào)[9]。文獻(xiàn)表明，14-3-3蛋白作為特定的磷酸化蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白，通過(guò)抑制其磷酸化使蛋白質(zhì)失活或通過(guò)阻止其去磷酸化來(lái)增強(qiáng)蛋白質(zhì)的活性。YWHAE可以通過(guò)參與ERK/MAPK途徑上調(diào)胃癌SGC7901細(xì)胞的生物活性。抑制YWHAE活性可能更有效地抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)[10]。Abdul等[11]發(fā)現(xiàn)YWHAE蛋白在大腦中高表達(dá)，并且與在神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用的蛋白質(zhì)相互作用。

YWHAE表達(dá)的改變可能在各種腫瘤類型中很常見；然而YWHAE在CRC中的意義還沒(méi)有被研究。在本研究中，我們通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用及蛋白印跡分別驗(yàn)證了YWHAE在CRC組織中上調(diào)表達(dá)。這表明YWHAE可能在CRC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，且有潛力作為早期的生物標(biāo)志物以及CRC治療的基因靶點(diǎn)。